بوته را در قاعده ساقه و اطراف ريشه به عمق 10-15 سانتي متر کنار زده و آن ناحيه را به خوبي تميز نموده، سپس در ناحيه ريشه با تيغه هاي مخصوص عمل تکه برداري انجام مي شود که بلافاصله شيره سفيدرنگ از محل تيغ زده خارج شده و به تدريج در مجاروت هوا سفت و قهوه اي مي گردد. براي اينکه شيرابه حاصل با خاک تماس پيدا نکند تخته سنگ کوچکي در زير محل برش قرار داده شد (حلاقي مرني و همکاران، 1365).

3-2 مواد شيميايي
اتانول 96درصد، شرکت زکريا جهرم، جهرم، ايران
متانول 5/99 درصد، مجللي، تهران، ايران
سولفات سديم از نوع آزمايشگاهي
راديكال آزاد DPPH از شركت سيگما، آمريكا
محيط کشت مولر هينتون آگار
محيط کشت مولر هينتون براث

3-3 وسايل و تجهيزات
ترازو ديجيتال 200 گرم مدل AndGulfبا دقت 1/0 ساخت کشور کره
ترازو ديجيتال 210 گرم مدل And با دقت0001/0 ساخت کشور ژاپن
قيف بوشنر
پمپ خلاء Platinum ساخت کشور آمريکا
روتاري Heidolph ساخت کشور آلمان
آون تحت خلاء Heidolph ساخت کشور آلمان
ورتکس Heidolph ساخت کشور آلمان
اسپکتوفتومتر Jenway 6305 ساخت انگلستان
سانتريفوژ sigma ساخت کشور آلمان
دستگاه GC-MASS از نوعHewlet-packaark
سمپلر
پليت 8 سانتي متري
سواپ

3-4 تهيه عصارهها
به منظور استخراج عصاره صمغ باريجه از روش ماسراسيون129 (خيساندن) استفاده شد. به منظور استخراج عصاره صمغ باريجه به روش حلال سرد، از سه حلال متانول و اتانول و آب به طور جداگانه استفاده شد .به اين ترتيب كه صمغ باريجه و حلال به نسبت5:1 (وزني:حجمي) با هم مخلوط شد و اختلاط به مدت 48 ساعت در دماي محيط روي شيكر انجام شد. سپس فيلتراسيون با استفاده از كاغذ صافي واتمن شماره يک و قيف بوشنر به کمک پمپ خلأ انجام شد. براي عصارههاي آبي از دستگاه سانتريفوژ با سرعت 4000 دور در دقيقه به مدت 15 دقيقه استفاده شد.قبل از صاف كردن توسط كاغذ صافي به عصاره استخراج شده اجازه داده شد تا بخش جامد براساس اختلاف دانسيته با حلالهاي مورد استفاده، از حلال جدا گردد.
پس از گذشت مدت مورد نظر (48 ساعت) عصاره هاي بدست آمده را به منظور سهولت کار در مرحله صاف کردن ابتدا با استفاده از پارچه کاملاً تميز آن را صاف نموده و سپس از قيف پوشنر استفاده شد (هاربون130 و همکاران، 1358).

3-5 خشک کردن عصاره
ابتدا با استفاده از دستگاه تقطير در خلاء131 از عصاره ها حذف حلال شد. البته چون حذف حلال در فشار پايين صورت مي گيرد دما بالا نرفته و مواد حساس به حرارت از بين نمي رود. سپس آن را در داخل ظرف در بازي و در داخل آون 50 -40 درجه سانتي گراد قرار داده، هرچند ساعت آن را کاملاً هم مي زنيم تا لايه رويي مانع تبحير نشود اين کار تا زماني ادامه مي يابد که عصاره حداقل 12 ساعت در داخل آون قرار داشته و کاهش وزن آن کمتر از 01/0 گرم شود. در اين مرحله عصاره به عنوان عصاره خشک در نظر گرفته شده و در يخچال نگهداري شد (سوو همکاران،2007) اين روش آماده سازي در هر حلال با سه بار تكرار انجام شد.
3-6 تعيين راندمان استخراج عصارهها
عصاره تغليظ شده در سطح پليتهاي شيشهاي به صورت ورقه نازك پخش و آنگاه به آون تحت خلاء با دماي 40 درجه سانتي گراد منتقل گرديدند تا باقيمانده حلال هم حذف گردد. پس از خشك شدن، عصاره ها بوسيله تيغه فلزي از روي سطح پليت هاي شيشه اي خراش داده و تا رسيدن به وزن ثابت خشك، در دسيكاتور قرار گرفتند.
راندمان استخراج عصاره هاي به دست آمده از روش حلال سرد، توسط سه حلال متانول و اتانول و آب با توزين پليتها (خالي و پس از خشک شدن عصاره) تعيين گرديد (حسني و همکاران 1390).

3-7 استخراج و تجزيه روغن فرار(اسانس)
براي اسانس گيري از صمغ باريجه از روش تقطير با بخار آب132 توسط کلونجر 133 استفاده شد.
براي اين منظور مقدار 100 گرم از صمغ باريجه را با روش تقطير با آب و با دستگاه کلونجر به مدت 3 ساعت(ثابت ماندن ميزان اسانس در لوله مندرج)اسانس گيري شد.اسانس به دليل ترکيبات خود معمولاً داراي چگالي کمتر از آب است و به همين خاطر روي آب قرار مي گيرد. اسانس بدست آمده با استفاده از سولفات سديم خشک آبگيري و تا قبل از آناليز در يخچال نگهداري شد.

3-7-1جدا سازي و شناسايي اجزاي روغن فرار
براي تفکيک و شناسايي مواد موجود در اسانس از دستگاه گاز کروماتوگرافي استفاده شد.

3-7-1-1مشخصات و برنامه دمايي دستگاه GC-MASS
دستگاه کروماتوگرافي گازي از نوع Hewlet- packaard
باستون به طول 30 متر، قطر داخلي 25/0 ميلي متر و ضخامت لايه 25/0 ميکرومتر از نوع Hp-5ms بود.

3-7-1-2برنامه حرارتي
دماي ابتدايي آون 50درجه سانتي گراد و دماي انتهايي 280 درجه سانتي گراد در هر دقيقه بود. افزايش دما تا 50 درجه سانتي گراد پس از 2 دقيقه توقف در اين دما، افزايش تا 200 درجه سانتي گراد با سرعت 5/3 درجه سانتي گراد در هر دقيقه و توقف در اين دما تا دو دقيقه، سپس با سرعت 7 درجه سانتي گراد در هر دقيقه به 280 درجه سانتي گراد رسانيده شد.
گاز حامل: هليوم، سرعت جريان گاز 1 ميلي ليتر براي هر دقيقه (معصومه خان احمدي و همکاران، 1385)

شماره
Component (GC/MS)
? درصد
شماره
Component (GC/MS)
? درصد
?
a-Thujene
3.3
10
Myrtenal
0.5
2
a- Pinene
18.3
11
a-Cubebene
0.4
3
Camphene
0.2
12
a-Elemene
0.9
4
Sabinene
3.1
13
Germacrene-D
0.9
5
b-Pinene
50.1
14
b-Gurjunene
1.8
6
a-Phellandrene
0.3
15
a-Muurolene
0.8
7
d-3-Carene
6.7
16
d- Cadinene
1.2
8
Allo-ocimene
2.9
17
b-Sesquiphellandrene
1.1
9
b-Phellandrene
2.1

3-7-2 آماده کردن اسانس
از آنجا که اسانس صمغ باريجه در محيط هاي کشت نامحلول هست، به يک امولسيفاير که اسانس را بدون داشتن اثرات ضد ميکروبي چشم گير در خود حل کند نياز است. از اين رو از ماده دي متيل سولفواکسايد134 به عنوان حلال استفاده شد، و با انجام يکسري آزمايش هاي متناوب بهترين ميزان حلاليت براي اسانس صمغ باريجه بدست آمد. سپس در لوله هاي استريل به طور جداگانه ميزان 25 ميکروليتر از اسانس صمغ باريجه را ريخته و سپس 975 ميکروليتر از حلال DMSO اضافه کرده و توسط شيکر به هم زده تا محلول به طور کامل شفاف شود. از اين استوك اوليه براي انجام آزمايش هاي بعدي استفاده گرديد.

3-8 باکتري هاي مورد مطالعه
ميکروارگانيسم هاي مورد استفاده در اين تحقيق عبارتند از:استافيلو کوکوس اورئوس واشيرشيا کلي.
ميکروارگانيسم هاي فوق در دسترس بودند و در عين حال به نمايندگي از باکتري هاي گرم مثبت و منفي انتخاب شدند.آمپول ليفوليزه باکتري هاي مورد استفاده زير هود ودر شرايط استريل باز شده وبه محيط کشت مايع مولر هينتون انتقال يافت و سپس به مدت 24 ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتي گراد قرار داده شد. سپس از محيط کشت 24 ساعته يک چرخش کامل برروي محيط هاي مورب و همچنين کشت خطي برروي پليت هاي مولر هينتون آگار انجام داده شد و به مدت 24ساعت در گرمخانه 37 درجه سانتي گراد قرار داده شد تا به عنوان منبع باکتري مورد استفاده قرار گرفت.

3-8-1 تعيين سوسپانسيون ميکروبي معادل نيم مک فارلند
هدف از تهيه نيم مک فارلند, جهت استاندارد کردن تلقيح براي آزمايشات ميکروبي بايد از استاندارد سولفات باريوم برابر با استاندارد نيم مک فارلند استفاده گردد.براي تهيه سوسپانسيون ميکروبي نياز به کشت 24 ساعته از هر باکتري مي باشد.بنابراين 24 قبل از انجام آزمايش از کشت ذخيره به محيط کشت شيبدار آگار مغزي تلقيح گرديد و به مدت 24 ساعت در دماي 37 درجه سانتي گراد گرمخانه گذاري شد.سپس کتوني هاي سطح محيط کشت با محلول سالين شسته شدو سوسپانسيون در طول موج 530 نانومتر با ميزان جذب محلول نيم مک فارلند برگردد. به عبارت ديگر سيوسپانسون توليدي بايستي حاوي 108*1.5 باشد.(نادري و همکاران،2004)

3-8-2تعيين حساسيت باکتري مورد مطالعه به صمغ باريجه به روش ديسک ديفيوژن135
به منظور بررسي اثرات ضد باکتريايي اسانس و عصاره صمغ باريجه از روش ديسک ديفيوژن استفاده شد.بدين منظور ابتدا از کشت 24 ساعته باکتري سوسپانسيوني معادل نيم مک فارلند تهيه شد.از عصاره هاي بدست آمده از گياه مورد نظر (عصاره هاي اتانولي, متانولي و آبي) رقت هاي (50 25 12.5 6.25) تهيه و به هر ديسک از رقت هاي مورد نظر اضافه و به مدت 24 ساعت در گرمخانه 37درجه سانتي گراد خشک گرديد.سپس به مقدار کافي از محيط کشت مولر هينتون آگار به درون پليت هاي استريل ريخته و اجازه داده شد تاسفت شود.سپس با يک سواپ استريل در سوسپانسون ميکروبي فرو برده, بعد از فرو بردن سواپ استريل در سوسپانسيون ميکروبي اضافه محلول با فشار دادن به کناره لوله گرفته شدو سپس در تمام ظرف پليت حاوي محيط کشت مولر هينتون آگار کشيده گرديد.در مرحله بعد با استفاده از پنس استريل ديسک هاي آغشته شده به صمغ باريجه در سطح محيط کشت قرار گرفته و با کمي فشار بر روي محيط کشت ثابت گرديد.پليت ها در حرارت37 درجه سانتي گراد به مدت24 ساعت در انکوباتور قرار داده شد. همچنين آنتي بيوتيک استاندارد پني سيلين به عنوان کنترل مثبت استفاده گرديد.(اينوي136 و همکاران،2001)
پس از آن با استفاده از خط کش دقيق قطر هاله عدم رشد بر حسب ميلي متر اندازه گيري شد.
اگرقطر هاله عدم رشد 12 ميلي متر يا کمتر باشد باکتري مورد نظر نسبت به آن اسانس يا عصاره مقاوم ،اگرقطرهاله عدم رشد بين 13-14 ميلي متر باشد؛اسانس و عصاره مورد نظر داراي اثرات ضد ميکروبي متوسط و اگر قطر هاله عدم رشد بيشتر از 15 ميلي متر باشد ميکروارگانيزم نسبت به آن اسانس يا عصاره حساس محسوب شد.
آزمون ها براي هر عصاره و هر ميکروارگانيسم حداقل 3 بار تکرار و ميانگين نتايج گزارش داده شد.تفاوت اثر ضد باکتريايي عصاره مختلف توسط آزمون آناليز واريانس ANOVA انجام گرديد.

3-8-3 تعيين MIC137 بر روي باکتري هاي مورد مطالعه
براي تعيين حداقل غلظت مهار کننده يک سري ده تايي از لوله هاي استريل حاوي يک ميلي ليتر محيط کشت مولر هينتون براث از يک تا ده شماره گذاري شد.توسط سمپلر يک ميلي ليتر از استوک اوليه ساخته شده از اسانس را به لوله اول هر سري اضافه نموده پس از اينکه توسط ورتکس محلول اسانس و محيط کشت به ميزان کافي مخلوط شد يک ميلي ليتر از لوله اول برداشته و وارد لوله دوم نموده و مخلوط کردن از لوله دوم به سوم… و اين عمل را تا لوله دهم تکرار کرده و از لوله شماره ده پس از مخلوط کردن يک ميل ليتر برداشته و دور ريخته مي شد.بدين ترتيب تمام لوله ها حاوي يک ميلي ليتر مايع بوده با اين تفاوت که يک شيب غلظت از لوله اول به سمت لوله شماره ده ايجاد شده که رقت در آنها رو به کاهش است و هر لوله حاوي نصف رقت اسانس در لوله قبلي است.براي تهيه سوسپانسيون ميکروبي از کشت 24 ساعته سويه مورد نظر پنج کلني توسط آنس استريل در نزديکي شعله برداشته و به داخل لوله حاوي سرم فيزيولوژي استريل برده وسپس داخل انکوباتور 37 درجه سانتي گراد قرار داده شد.پس از 2تا5 دقيقه کورت لوله با کدورت استاندارد نيم مک فارلند مقايسه نموده در صورت اختلاف با افزودن سرم فيزيولوژي استريل يا کلني باکتري کدورت محلول باکتريايي را معادل نيم مک فارلند رسانده ، سپس 50 از سوسانسيون ميکروبي به تمام لوله ها اضافه کرده. لازم به ذکر است که يک لوله نيز به عنوان شاهد در هر نوبت منظور گرديد که فاقد عصاره بوده و به همان تعداد باکتري (106 در هر ميلي ليتر) در آن تلقيح شده لوله ها در مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتي گراد گرمخانه گذاري شده و سپس مورد مشاهده قرار گرفته و از سمت لوله شاهد کدورت لوله ها مورد بررسي قرار گرفته و

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید