ر محلولي با رقت 2-10 چند بار شسته شده و مجدداً يک ميلي ليتر از اين رقت به ظرف پتري سترون وارد شد. به همين ترتيب عمليات تا رقت 1-10 ادامه يافت. به سرعت محيط کشت که درجه حرارت آن نبايد بيش از 45 درجه سانتي گراد باشد، به ظروف پتري محتوي نمونه منتقل شد و سپس براي مخلوط شدن نمونه با محيط کشت، ظرف پتري بطور واژگون در دماي 32 درجه سانتيگراد به مدت 48 ساعت در انکوباتور قرار گرفت و بعد از 48 ساعت، نتيجه آزمايش بررسي و تمام پرگنه هايي که در ظرف پتري ظاهر شده بودند، شمارش شد. براي شمارش، تعداد پرگنه هاي شمارش شده در عکس رقت ضرب شده و بر وزن نمونه تقسيم و به صورت cfu/gr بيان شد. در همه مراحل اين آزمايش وسايل مورد استفاده، قبل از بکارگيري با استفاده از شعله و الکل 70% استريل شدند [27].

ـ کشت و جدا سازي باکتري ها
به جز باکتري رني باکتريوم سالمونينارم، همه باکتريهاي بيماريزا در ماهي، از گروه باکتريهاي هوازي هستند و براي جداسازي آنها از محيط کشت جامد استفاده مي نمايند. باکتريها اغلب به صورت خالص جدا مي شوند، اما در مورد باکتريهاي داخل غذا اين حالت وجود ندارد، بلکه امکان جداشدن چند گونه باکتري وجود دارد.
بعد از کشت اوليه و جدا شدن باکتريها، براي خالص سازي باکتريها بايد از محيط هاي مناسب غير انتخابي و انتخابي و يا از هر دوي آنها استفاده نمود. توضيح آنکه در محيط هاي غير انتخابي امکان رشد طيف وسيعي از باکتريها وجود دارد. به عنوان مثال مي توان دو محيط کشت تريپتون سوي آگار53 و آگار قلب و مغز54 را نام برد ولي در محيط هاي انتخابي، فقط گروهي از باکتريها مي توانند رشد کنند. مثل محيط هاي: آگار ستريميد، به جهت برخورداري از عوامل جلوگيري کننده رشد ديگر باکتريهاي گرم منفي و داشتن کلريد منيزيم و سولفات پتاسيم فقط مناسب رشد پزودوموناس ها55 است. و يا تيوسيترات بايل سوکروز آگار56 که فقط براي رشد گونه هاي ويبريو مناسب مي باشد.
پس از جدا و خالص سازي، براي شناسايي باکتريها از روش هاي معمول در آزمايشگاهاي تشخيص ميکروبشناسي، يعني از روشهاي بيوشيميايي و محيط هاي کشت افتراقي استفاده گرديد. پس از رنگ آميزي باکتريها و در صورت پذيرش رنگ آبي و يا بنفش، آنها در گروه باکتريهاي گرم مثبت قرارگرفتند. جدول (3ـ4) استفاده شد [28].
جدول (3ـ5) ريخت شناسي و نتايج تست کاتالاز کوکوس ها
نام باکتري
ريخت شناسي
تست کاتالاز
آئرو کوکوس
کوکسي در خوشه هاي کوچک
مثبت ضعيف و يا منفي ضعيف
ميکروکوکوس/ استافيلوکوکوس
کوکسي هاي خوشه اي
مثبت
استرپتوکوکوس
کوکوسي هاي زنجيره اي
منفي
لاکتوکوکوس
باسيل/ کوکوباسيل
منفي
نوکارديا
باسيل منشعب
منفي

و براي شناسايي باکتريهاي گرم منفي (باکتريهاي را که در رنگ آميزي به روش گرم، رنگ قرمز را قبول کردند) ابتدا با آزمايشات اکسيداز و اکسيداسيون و تخمير قند گلوکز از هم تفکيک (جدول 3ـ5) و سپس از محيطهاي کشت افتراقي (جدول 3ـ6) استفاده شد [28].

جدول (3ـ6) آزمايشات اکسيداز
اکسيداز مثبت
اکسيداز منفي
پزودوموناس، فلاوباکتريا، موراکسلا، ويبريوناسه و پاستورلاسه
اسينتو باکتر و آنتروباکترياسه آ

جدول (3ـ7) آزمايشات تشخيص مرجله دوم باکتريهاي گرم منفي
حرکت، بتاگلاکتوسيداز، ارژنين دهيدرولاز، ليزين دکربوکسيلاز، اورنيتين دکربوکسيلاز، مصف سيترات، فعاليت اوره از، توليد سولفيد هيدروژن، توليد اندول، واکنش متيل رد، واکنش vp، هيدرولاز ژلاتين، تحمل نمک 3 و 7%، تحمل حرارت 5 و 37 درجه سانتي گراد، هيدروليز اسکولين

توليد گاز از: گلوکز
توليد اسيد از: آرابينوز، گلوکز، اينوزيتول، مانيتول، رامنوز، سالسين، سوربيتول، سوکروز و ترهالوز

ـ جداسازي و شناسايي قارچ هاي ساپروفيت
براي جداسازي و شناسايي قارچهاي ساپروفيت از غذاي خشک اکسترود مورد استفاده در پرورش ماهي، پس از چند بار شستشو با آب مقطر استريل، تعدادي از گرانولهاي غذا در ظرفي استريل که حاوي آب مقطر استريل و آنتي بيوتيکهاي کلرامفنيکل وجنتامايسين به ميزان (18 قطره کلرامفنيکل و 1 سي سي جنتامايسين) است به مدت 2 ساعت در حرارت آزمايشگاه قرار مي گيرد. پس از آن گرانولهاي غذا، ليز شده و پس از همگن کردن غذاي حل شده، يک سيسي از آن به محيط کشت پتيتودکستروزاگار57 و سابرودکستروز آگار58 حاوي کلرامفنيکل و جنتامايسين تلقيح شده و پليتها در حرارت 20 – 25 درجه سانتي گراد به مدت 3ـ5 روز در گرمخانه ليبره شده قرار گرفتند. پس از کشت اوليه از کلنيهاي بدست امده کشت مجدد تهيه ميشد و پس از کامل شدن کلنيها جهت ارزيابي خصوصيات ميکروسکوپي از کلني ها اسلايد تهيه و با لاکتوفنل کاتن بلو رنگ آميزي شد و از روي شکل قارچها نوع قارچ شناسايي گرديد.
ـ شمارش کلي قارچ ها
براي شمارش تعداد کلي قارچها59 مثل شمارش تعداد کلي باکتريها است و فقط از محيط کشت سابرو دکستروز اگار حاوي دو آنتي بيوتيک کلرامفنيکل و جنتامايسين استفاده گرديد.

فصل چهارم
نتايج و بحث

4ـ1 مقدمه
براي تجزيه و تحليل كليه دادهها، از نرم افزارSPSS18 Stats Direct و براي رسم نمودارها از برنامه Excel 2010 استفاده گرديد. دادهها ابتدا جهت اطمينان از نرمال بودن با آزمون Shapiro-wilk بررسي شدند سپس در صورت نرمال بودن توزيع دادههاي مورد بررسي، با استفاده از آزمون تجزيه واريانس يكطرفه60 در سطح اطمينان 95%، ابتدا اختلاف كلي بين ميانگين ها مشخص و سپس با آزمون دانکن61، گروهها از يكديگر تفكيك گرديدند و در مواقعي كه داده ها نرمال نبودند، از آزمون ناپارامتري كروسكال ـ واليس62 جهت مقايسه تيمارها و از آزمون من ويتني63 براي مقايسه جفتي بين تيمارها استفاده شد.

4ـ2 نتايج
4ـ2ـ1 نتايج زمان صفر
4ـ2ـ1ـ1 توتال کانت باکتري (N/g)
با توجه به آزمون آناليز واريانس يكطرفه، بين تيمارهاي مورد بررسي از نظر ميانگين توتال کانت باکتري اختلاف معني دار آماري مشاهده گرديد (P<0.05). و بر اساس آزمون دانکن، اختلاف توتال کانت باکتري بين تيمارهاي مورد بررسي معنيدار بوده است. حروف لاتين غير مشابه، نشان دهنده اختلاف بين تيمارها است (p<0.05). نمودار (4ـ1) ميانگين توتال کانت باکتري در تيمارهاي مورد بررسي در تصوير فلور باکتريايي 6 نوع غذاي مورد بررسي (استارترهاي 1و 2، رشد و پرواريهاي 1، 2 و 3) باکتريهاي: آئروموناس اس پي، استافيلوکوکوس اس پي، ميکروکوکوس، باسيلوس و انترباکترياسه شناسايي و جداسازي گرديد و در بين اين دسته از باکتريها، باکتريهاي گرم مثبت مثل ميکروکوکوس، استافيلوکوکوس و باسيلوس از بيشترين فراواني برخوردار بودند. 4ـ2ـ1ـ2 توتال کانت قارچ(N/g) با توجه به آزمون کروسکال- واليس، بين تيمارهاي مورد بررسي از نظر ميانگين توتال کانت قارچ اختلاف معنيدار آماري مشاهده گرديد (P<0.05). و آزمون من ـ ويتني نشان ميدهد که بين تيمارهاي زير از نظر فاکتور توتال کانت قارچ اختلاف معني دار آماري وجود دارد. نمودار (4ـ2) ميانگين توتال کانت قارچ در تيمارهاي مورد بررسي در تصوير فلور قارچي 6 نوع غذاي مورد بررسي (استارترهاي 1و 2، رشد و پرواريهاي 1، 2 و 3) قارچهاي: فوزاريوم، پنيسيليوم، ريزوپوس و موکور شناسايي و جداسازي شد و در بين اين دسته از قارچها فوزاريوم، موکور و ريزوپوس از فراواني بيشتري برخوردار بودند. 4ـ2ـ1ـ3 T.V.N (mg/100g) با توجه به آزمون آناليز واريانس يكطرفه، بين تيمارهاي مورد بررسي از نظر ميانگين T.V.N اختلاف معني دار آماري مشاهده گرديد (P<0.05). و بر اساس آزمون دانکن، اختلاف T.V.N بين تيمارهاي مورد بررسي معني دار بوده است. حروف لاتين غير مشابه، نشان دهنده اختلاف بين تيمارها است (p<0.05). نمودار (4ـ3) ميانگين T.V.N در تيمارهاي مورد بررسي 4ـ2ـ1ـ4 پراکسايد (meq/1000g) با توجه به آزمون آناليز واريانس يكطرفه، بين تيمارهاي مورد بررسي از نظر ميانگين پراکسايد اختلاف معنيدار آماري مشاهده گرديد (P<0.05). و بر اساس آزمون دانکن، اختلاف پراکسايد بين تيمارهاي مورد بررسي معنيدار بوده است. حروف لاتين غير مشابه، نشان دهنده اختلاف بين تيمارها است (p<0.05) نمودار (4ـ4) ميانگين پراکسايد در تيمارهاي مورد بررسي 4ـ2ـ1ـ5 قطر خوراک (mm) با توجه به آزمون آناليز واريانس يكطرفه، بين تيمارهاي مورد بررسي از نظر ميانگين قطر خوراک اختلاف معنيدار آماري مشاهده گرديد (P<0.05). و بر اساس آزمون دانکن، اختلاف قطر خوراک بين تيمارهاي مورد بررسي معنيدار بوده است. حروف لاتين غير مشابه، نشان دهنده اختلاف بين تيمارها است (p<0.05). نمودار (4ـ5) ميانگين قطر خوراک در تيمارهاي مورد بررسي 4ـ2ـ1ـ6 پروتئين (% ) با توجه به آزمون آناليز واريانس يكطرفه، بين تيمارهاي مورد بررسي از نظر ميانگين پروتئين اختلاف معني دار آماري مشاهده گرديد (P<0.05). و بر اساس آزمون دانکن، اختلاف پروتئين بين تيمارهاي مورد بررسي معني دار بوده است. حروف لاتين غير مشابه، نشان دهنده اختلاف بين تيمارها است (p<0.05). نمودار (4ـ6) ميانگين پروتئين در تيمارهاي مورد بررسي 4ـ2ـ1ـ7 چربي (% ) با توجه به آزمون آناليز واريانس يكطرفه، بين تيمارهاي مورد بررسي از نظر ميانگين چربي اختلاف معني دار آماري مشاهده گرديد (P<0.05). و بر اساس آزمون دانکن، اختلاف چربي بين تيمارهاي مورد بررسي معني دار بوده است. حروف لاتين غير مشابه، نشان دهنده اختلاف بين تيمارها است (p<0.05). نمودار (4ـ7) ميانگين چربي در تيمارهاي مورد بررسي

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید