انکوباتور 37 درجه
3-16-1- روش انجام RFLP باآنزيمAlu1:
ابتدا در داخل اپندورف‏ها مقدار 17 ميکروليتر محصول PCR، 2 ميکروليتر بافر آنزيم، 1 ميکروليتر آنزيم محدودالاثر Alu1 مي‌ريزيم. آنها را به خوبي سمپلينگ و ميکس کرده (ورتکس انجام نشود. ). نمونه‏ها را طبق دستور العمل آنزيم به مدت 3 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتي گراد قرار مي‌دهيم. تا انکوبه شوند و سپس با ولتاژ پايين 60 در ژل اگارز 1. 5 درصد الکتروفورز مي‌کنيم.
3-16-2- انجامRFLP باآنزيم محدودالاثر EcoR1:
وقتي ما الگوهايي که پس ازاضافه کردن آنزيمAlu1 بايد داشته باشيم را با استفاده از سايت http://tools. neb. com/NEBcutter2/index. php دراورديم، مشاهده کرديم بايد چهار گروه داشته باشيم که دو گروه آن بااين آنزيم سايت برش مشابهي مي‌دهند يعني فقط يک قطعه 1026 مشاهده مي‌کنيم و قطعه ديگر147 که به سختي مشاهده مي‏شود.در نتيجه براي جدا کردن اين دو گروه بايد از آنزيم ديگري که الگو متفاوتي مي‌دهد استفاده نماييم که ما آنزيمEcoR1 راانتخاب نموديم. روش کار آن مشابه آنزيمAlu1 مي‌باشد.
3-17- تعيين توالي41و پردازش داده ها:
اين تکنيک امکان دسترسي ميکروبيولوژيست‏ها را به ژن‌هاي مختلف مي‌دهد. بيشتر براي تعيين توالي از روش سانگر(سانجر) استفاده مي‌کنند. ارائه خدمات تعيين توالي توسط آزمايشگاه‌هايي که اختصاص به اين کار دارند و داراي تجهيزات پيشرفته هستند، انجام مي‏شود. براي تعيين توالي يک قطعه PCRشده دو روش عمده وجود دارد:
1-کلون کردن محصول PCR شده روي پلاسميد و ارسال آن براي تعيين توالي
2-ارسال مستقيم محصول PCR شده براي تعيين توالي
در اين مطالعه از روش دوم استفاده شد.
3-17-1- ارسال نمونه‏ها جهت توالي يابي قطعه تکثير شده:
نمونه‌هايPCR شده منتخب براي تعيين توالي (25ميکروليتر)، پرايمرهاي F و R (به حجم 15 ميکروليتر و غلظت 10p. mol) در اپندورف‌هاي 1. 5، به همراه عکس ژل نمونه‏ها که داراي باندbp 1173ژن ompP2 به شرکت تکاپوزيست فرستاده شد. بايد توجه داشت نمونه‏ها حتما بر روي يخ قرار داشته باشند.
نتيجه تعيين توالي از طريق نرم افزارMega4 مشاهده و بررسي گرديد و BLAST آنها در EMBL/Gene Bank databases انجام شد. (www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST). سکانس مربوط به نمونه‏ها بعد از آناليز توسط نرم افزار Mega4 در (www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST) گزارش و ثبت گرديد.

فصل چهارم:
تجزيه و تحليل داده ها

4-1- تعداد نمونه‏ها و ايزولاسيون:
تعداد30 نمونه از بيمارستان ميلاد و امام خميني از شهريور 1389 تا شهريور 1391جمع‌آوري گرديد. ايزوله‌ها از نمونه‌هاي متفاوت بيماران عفوني شامل حلق، چشم، بيني جدا شده است. )جدول 4-1)
جدول 4-1- اطلاعات نمونه‌هاي دريافتي از بيماران مورد مطالعه
توضيحات
محل جداسازي
سن بيمار
شماره ايزوله
NTHi
چشم
يک ماهه
1
NTHi
چشم

2
NTHi
چشم

3
NTHi
تنفسي
نوزاد
4
NTHi
مايع شستشوي ريه

5
NTHi
حلق
سه ماهه
6
NTHi
حلق
1 ساله
7
NTHi
حلق
4ساله
8
NTHi
حلق
31 ساله
9
NTHi
حلق
28 ساله
10
NTHi
حلق
32 ساله
11
NTHi
حلق

12
NTHi
بيماري تنفسي

13
NTHi
بيماري تنفسي
1 ساله
14
NTHi
بيماري تنفسي
2
30
NTHi
بيماري تنفسي
1
35
NTHi
بيماري تنفسي
4
37
NTHi

1
38
NTHi
بيماري تنفسي
6 ماه
40
NTHi
بيماري تنفسي
6
43
NTHi

2
47
NTHi
بيماري تنفسي
2
49
NTHi
بيماري تنفسي
6 ماه
52
NTHi

5
89
NTHi

3
103
NTHi
بيماري تنفسي
4
104
NTHi

2
109
NTHi
بيماري تنفسي
6 ماه
119
NTHi


120
NTHi
بيماري تنفسي

132
4-2-تستهاي بيوشيميايي:
پس از کشت و خالص سازي نمونه‌ها، جهت تاييد حضور و رشد هموفيلوس آنفلوانزا، از تست‌هاي بيوشيميايي اکسيداز،کاتالاز،اوره از، ايندول استفاده شد. اکسيداز مثبت،کاتالاز مثبت،اوره آز مثبت، توليد ايندول مثبت ،اورنيتين دکربوکسيلاز مثبت بود.
4-3-نتايج بررسي کميت و کيفيت DNA استخراج شده:
جدول 4-2 نتايج بررسي کميت و کيفيت DNA استخراج شده
Ng/nl
280/260
شماره نمونه
248.2
1.85
1
396.2
1.90
2
416.6
1.70
3
600.5
1.70
4
509.4
1.96
5
492.1
1.86
6
209.5
1.81
7
381.2
1.65
8
319.5
1.195
9
274.4
1.67
10
345.9
1.88
11
242.2
1.45
12
513.8
1.96
13
296.7
1.98
14
219.9
1.66
30
219.9
1.59
35
182.7
1.99
37
398.9
1.79
38
153.8
1.59
40
193.5
1.68
43
269.5
1.80
47
546.5
1.94
49
404.8
1.66
52
193.4
1.58
89
171.7
1.82
103
185.1
1.62
104
179.8
1.44
109
114.5
1.34
119
175.1
1.58
120
205.4
1.84
132

4-4- PCRژن ompP2 ايزوله‌هاي باليني هموفيلوس آنفلوانزا:
PCR، با استفاده از جفت پرايمر اخصاصي طراحي شده انجام شد.وزن مولکولي باند مورد نظر 1173bp است، که در شکل :(4-1 ) نشان داده شده است.

شکل4-1- ژن ompP2ايزوله‌هاي باليني
C+ :سويه کنترل مثبت مي‌باشد. که نشان دهنده تائيد کار ما مي‌باشد.
C-:کنترل منفي ما مي‌باشد. در صورت مثبت شدن نشان دهنده آلودگي محصول PCR ما مي‌باشد. در آن به جاي DNA از آب مقطر استفاده شد.
به ترتيب از سمت چپ به راست:DNA Lader 100 bp، کنترل مثبت، نمونه‌هاي شماره 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11، 12، 13، 14، کنترل منفي
4-5- RFLP:
, RFLPبراي همه ايزوله‌هاي باليني انجام شد. ابتدا از آنزيمAlu1 استفاده شد. اين آنزيم يک اندونوکلئاز محدود کننده‏اي است که از باکتري Arthrobacterluteus استخراج مي‏شود و برش ساده‏اي را در ميان جايگاه شناسايي (AG/CT ) بر روي DNA دورشته‏اي ايجاد مي‌کند و نتيجه آن ايجاد دو انتهاي صاف ياblunt end مي‌باشد. و داراي جايگاه تفرق دهنده‏اي براي ژن ompP2 مي‌باشد. از 30 ايزوله باليني12مورد الگوي سه باند يکسان داشتند که مشابه سويه‌هاي استاندارد بودند. 3 مورد الگوي سه باند متفاوت داشتند که با سويه استاندارد هم خواني نداشتند. 6 تا از نمونه ها الگوي دو باند را نشان دادند که اين هم الگوي جديدي بود. 9 تا از نمونه‏ها هم الگوي يکسان تک باند را نشان دادندکه با دو تا از الگو‌هاي استاندارد ما مشترک بودند و براي تفرق آنها از آنزيمECO R1 استفاده کرديم. که همه عضو يک گروه تک بانده بودند. ECO R1،توالي G/AATTC را به صورت Sticky يا چسبنده برش مي‌دهد.

شکل 4-2و4-3- جايگاه برش آنزيم محدودالاثرAlu1 براي ژن ompP2 ايزوله‌هاي باليني
نمونه‌هاي شماره‌هاي 3-5-8-14-47داراي الگوي متفاوت از بانک ژني هستند.
به ترتيب از چپ به راست Lader 100bp ونمونه 3، 14، 30، 35، کنترل مثبت و RFLPکنترل مثبت.
به ترتيب از چپ به راست Lader 100bp ونمونه 1، 5، 47، 8، 13، RFLP کنترل مثبت و کنترل مثبت.

شکل 4-4- جايگاه برش آنزيم محدودالاثرECOR1 براي ژن ompP2 ايزوله‌هاي باليني
به ترتيب از چپ به راست: Lader 100bp، 14، 20، 10، 18، RFLP کنترل مثبت و کنترل مثبت.
4-6:نتايج تعيين توالي (Sequencing) و ثبت توالي‌ها درديتابيسGeneBank/EMBL:
پس از يک هفته از تحويل نمونه‏ها، کروماتوگرام و سکانس هر کدام از باندهاي DNA در يک لوح فشرده به صورت فرمت AB1از شرکت تکاپو زيست ارائه گرديد. سکانس‏ها بااستفاده از نرم افزار MEGA4(دستورView/Edit Sequencer-File Alignment)مشاهده گرديد. شکل (شکل4-5 و 4-6)سپس BLAST هر کدام از سکانس‏ها از طريق گزينه DO BLAST Searchدر همان دستورAlignment انجام گرديدند. پس از پردازش سکانس‏ها از طريق نرم افزار MEGA4، توالي هر کدام از نمونه‏ها در ديتابيس بانک ژني گزارش و ثبت گرديد.

شکل 4-5- کروماتوگرام به دست آمده از تعيين توالي ژن ompP2 نمونه شماره 14با پرايمرForward

شکل4-6- کروماتوگرام به دست آمده از تعيين توالي ژن ompP2 نمونه شماره 14 با پرايمرRevers
4-7- آناليز بازهاي حاصل از تعيين توالي نمونه ها:
4-7-1- آناليز بازهاي حاصل از تعيين توالي ايزوله باليني شماره 3:
از مقايسه ايزوله باليني شماره 3 با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني نتايج زير حاصل شد که در جدول 4-7نشان داده شده است. Alignment ،سکانس ايزوله شماره3 با موارد ثبت شده در بانک ژني به شرح زير است .Alignment .سکانس ompP2 ايزوله باليني شماره 3، با (AF052541. 1) با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني، 91% شباهت دارد. وهمچنين توالي نوکلئوتيدي و پروتئيني در NCBI، BLAST شد.

شکل 4-7- آناليز و مقايسه نمونه شماره 3 با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني و بررسي توالي اسيد آمينه آنها.
جايگاه برش آنزيمALU1با رنگ زرد نشان داده شده است

شکل 4-8- مناطق حفاظت شده پروتئين شماره 3
جدول 4-3- نتيجه Blast سکانس نوکلئوتيدي شماره 3 در NCBI

4-7-2. آناليز بازهاي حاصل از تعيين توالي ايزوله باليني شماره 5:
از مقايسه ايزوله باليني شماره 5 با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني نتايج زير حاصل شد. Alignment سکانس ايزوله باليني شماره 5 .با موارد ثبت شده در بانک ژني به شرح زير است. Alignment سکانسompP2 ايزوله باليني شماره 5، با (.CP000057. 2) با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني، 99%شباهت دارد.

شکل 4-9- آناليز و مقايسه نمونه شماره 5 با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني و بررسي توالي اسيد آمينه آنها .
جايگاه برش آنزيمAlu1 با رنگ زرد نشان داده شده است.

شکل 4-10- مناطق حفاظت شده پروتئين شماره 5
جدول 4-4- نتيجه Blast سکانس نوکلئوتيدي شماره 5 در NCBI

4-7-3- آناليز بازهاي حاصل از تعيين توالي ايزوله باليني شماره 8:
از مقايسه ايزوله باليني شماره 8 با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني نتايج زير حاصل شد. Alignment،سکانس ايزوله باليني شماره 8.با موارد ثبت شده در بانک ژني به شرح زير است. Alignment ،سکانسompP2 ايزوله باليني شماره 8، با (X73387. 1)با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني، 96%شباهت دارد.

شکل 4-11- آناليز و مقايسه نمونه شماره 8 با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني و بررسي توالي اسيد آمينه آنها.
جايگاه برش آنزيمAlu1 با رنگ زرد نشان داده شده است.

شکل 4-12- مناطق حفاظت شده پروتئين شماره 8
جدول 4-5- نتيجه Blast سکانس نوکلئوتيدي شماره 8 در NCBI

4-7-4- آناليز بازهاي حاصل از تعيين توالي ايزوله باليني شماره 35:
از مقايسه ايزوله باليني شماره 35 با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني نتايج زير حاصل شد. Alignment سکانس ايزوله باليني شماره35 با موارد ثبت شده در بانک ژني به شرح زير است. Alignment سکانس ompP2 ايزوله باليني شماره 35 با، (AY579215. 1) با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني، 93%شباهت دارد

شکل 4-13- آناليز و مقايسه نمونه شماره 35 با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني و بررسي توالي اسيد آمينه آنها.
جايگاه برش آنزيمAlu1 با رنگ زرد نشان داده شده است.

شکل 4-14- مناطق حفاظت شده پروتئين شماره 35
جدول 4-6- نتيجه Blast سکانس نوکلئوتيدي شماره 35 در NCBI

4-7-5- آناليز بازهاي حاصل از تعيين توالي ايزوله باليني شماره 47:
از مقايسه ايزوله باليني شماره 47با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني نتايج زير حاصل شد. Alignment سکانس ايزوله باليني شماره47 با موارد ثبت شده در بانک ژني به شرح زير است.Alignment ،سکانس ompP2 ايزوله باليني شماره 47 با (AY051399. 1) با اطلاعات ثبت شده در ژن بانک، 98%شباهت دارد.

شکل 4-15- آناليز و مقايسه نمونه شماره 47با اطلاعات ثبت شده

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید