در بانک ژني و بررسي توالي اسيد آمينه آنها .
جايگاه برش آنزيمAlu1 با رنگ زرد نشان داده شده است.

شکل 4-16- مناطق حفاظت شده پروتئين شماره 47
جدول 4-7- نتيجه Blast سکانس نوکلئوتيدي شماره 47 در NCBI

4-7-5- آناليز بازهاي حاصل از تعيين توالي ايزوله باليني شماره14:
از مقايسه ايزوله باليني شماره 14 با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني نتايج زير حاصل شد. Alignment سکانس ايزوله باليني شماره 14 با موارد ثبت شده در بانک ژني به شرح زير است. Alignment ،سکانسompP2 ايزوله باليني شماره 14 با، (M93270. 1) با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني، 99%شباهت دارد.

شکل 4-17- آناليز و مقايسه نمونه شماره 14 با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني و بررسي توالي اسيد آمينه آنها .
جايگاه برش آنزيمAlu1 با رنگ زرد نشان داده شده است.

شکل 4-18- نواحي حفاظت شده پروتئين شماره 14را نشان ميدهد.
جدول 4-8-. نتيجهBlast سکانس اسيد نوکئيک شماره 14 در NCBI

4-8- بررسي ميزان شباهت و تفاوت ايزوله‌هاي باليني تهران:
پس از انجام تکنيک RFLP وبراي تائيد آن تعيين توالي، ايزوله‌هاي باليني در شش گروه متفاوت قرارگرفتند. 2 گروه کاملاً شبيه با الگو‏ها و چهار گروه جديد.
1-گروهي که پس از برش DNA با آنزيم Alu1ايجاد يک تک باند کرد، مثل،
(ايزوله شماره 14 و سويه کنترل مثبت )، در اين گروه 9 ايزوله از 30 ايزوله ما قرار گرفتند.
2*- گروهي که پس از برش DNA با آنزيمAlu1 ايجاد دوباند کرد، مثل، (ايزوله شماره8). در اين گروه 6 ايزوله از 30 ايزوله ما قرار گرفتند.
3- گروهي که پس از برش DNA با آنزيمAlu1 ايجاد سه باند کرد، مثل (ايزوله شماره47). در اين گروه 12ايزوله از 30 ايزوله قرار گرفتند.
4*-ايزوله شماره 3، الگوي متفاوت و جديدي را نشان داد.
5*-ايزوله شماره 5، الگوي متفاوت و جديدي را نشان داد.
6*–ايزوله شماره 35، الگوي متفاوت و جديدي را نشان داد.
روي هم 9 ايزوله از30 ايزوله داراي الگوي جديد و متفاوت از الگوهاي قبل مي‌باشند.

نمودار 4-1- نتايج RFLP

نمودار 4-2- ميزان درصد هر يک از الگوها را نشان ميدهد.

نمودار 4-3- درصد جهش ها را نشان مي دهد.

شکل 4-19- مقايسه ساختماني اسيد آمينه پروتئين P2 ايزوله‌هاي باليني با همديگر

فصل پنجم:
بحث و نتيجه گيري

5-1- آناليز RFLP از ايزوله‌هاي باليني:
هدف از انجام اين تکنيک صرفا بررسي پلي مورفيسم براي باندهاي DNA با وزن مولکولي يکسان PCR شده حاصل از ژن ompP2 است. در اين مطالعه ابتدا از آنزيمAlu1 و سپسEcoR1 استفاده شد. آنزيمAlu1 توالي AG/CTرا برش ميزند و جايگاه برش تفرق دهنده‏اي براي ژن ompP2 مي‌باشد. نتيجه جالبي که از RFLP بدست آمد، 9 ايزوله با 4 الگوي مختلف از نمونه‌هاي ثبت شده در NCBI بدست آمد که اين نشان مي‌دهد که ژن ompP2 در کشور ايران در مقايسه با ساير کشورها در بعضي ايزوله‏ها دچار پلي مورفيسم در ناحيه برش آنزيم محدود الاثر Alu1 شده است. اما براي آنزيمEcoR1 همه ايزوله‌هاي تست شده يک الگو مطابق با باقي کشورها را نشان دادند.
5-2. آناليز و بررسي جهش‌هاي ايجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ايزوله شماره 3:
Alignment ،سکانس ompP2 ايزوله باليني شماره 3، با (AF052541. 1) با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني، 91%شباهت دارد. از مقايسه اين ايزوله با موارد ثبت شده درNCBI، جهش‌هاي زير در بازهاي اين ايزوله مشاهده شد. با تغيير در اين باز‏ها دو سايت برش متفاوت با آنزيمAlu1 به وجود آمده است
A42G43C44T45—-
A60G61C62T63—-
A290 C TGAT TGCT
A1077 G AACT AGCT
همچنين با استفاده از اين داده‌هاي ژني و تبديل آنها به اسيد آمينه با نرم افزار Expassy toolو Alignmentآنها توسط نرم افزارMEGA4 احتمال به وجودآمدن اسيد آمينه ‌هايي همچون (اسيدآمينه پرولين، اسيدآمينه آلانين) و حذف شدن (اسيد آمينه تيروزين، اسيد آمينه گلايسين) مي‌باشد. همان طور که مي‌دانيم پرولين يک اسيد آمينه است که در هر جاي پروتئين قرار بگيرد ايجاد خميدگي خواهد کرد. و وجود آلانين به علت داشتن بار مثبت، تغييرات شيميايي و فيزيکي در پروتئين ايجاد مي‌کند. اسيد آمينه تيروزين داراي حلقه مي‌باشد پس فضاي بيشتري را اشغال مي‌کند وقتي از زنجيره اسيد آمينه حذف مي‏شود فضاي آزاد تري را به وجود مي‌اورد. گلايسين کوچکترين اسيد آمينه است زيرا زنجيره جانبي ندارد و با حذف آن و قرار گرفتن يک اسيد آمينه بزرگتر باعث تغييرات زيادي خواهد شد. در نتيجه بايد به تغييرات فيزيکي و شيميايي که ممکن است به وجود آمده باشد نيز توجه داشت.
5-2-1آناليز و بررسي جهش‌هاي ايجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ايزوله شماره 5:
Alignmentسکانس ompP2 ايزوله باليني شماره 5، با (.CP000057. 2) با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني، 99%شباهت دارد. از مقايسه اين ايزوله با موارد ثبت شده درNCBI، جهش‌هاي زير در بازهاي اين ايزوله مشاهده شد. با تغيير در اين باز‏ها، سايت برش متفاوت با آنزيمAlu1 به وجود آمده است
A42G43C44T45 —-
A60G61C62T63 —-
G1115 C AGGT AGCT
در اين پروتئين نيز احتمال دارد اسيد آمينه ‌هايي نظير (فنيل الانين، پرولين، الانين، گلايسين) به وجود بيايند و اسيد آمينه ‏ي (تيروزين)حذف شود. فنيل آلانين جز اسيد آمينه ‌هاي آروماتيک مي‌باشد که باعث مي‌شوند فضاي بيشتري اشغال شود. پرولين نيز ايجاد خميدگي در حلقه مي‌کند. آلانين به علت بار مثبتش و گلايسين کوچک بودنش وقتي جاي اسيد آمينه ‌هاي بزرگ قرار مي‌گيرد باعث تغييرات فيزيکي و شيميايي در پروتئين مي‌شوند و همين طور حذف شدن تيروزين که يک اسيد آمينه داراي حلقه مي‌باشد و فضاي بيشتري را در پروتئين ايجاد مي‌کند.
5-2-2- آناليز و بررسي جهش‌هاي ايجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ايزوله شماره 8:
Alignment ،سکانسompP2 ايزوله باليني شماره 8، با (X73387. 1) با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني، 96% شباهت دارد.از مقايسه اين ايزوله با موارد ثبت شده درNCBI، جهش‌هاي زير در بازهاي اين ايزوله مشاهده شد. با تغيير در اين باز‏ها، سايت برش متفاوت با آنزيمAlu1 به وجود آمده است
A42G43C44T45 —-
A60G61C62T63 —-
T580C581G582T AGCT
در اينجا احتمال وجود اسيد آمينه ‌هايي نظير (فنيل الانين، تيروزين، الانين) پيش بيني مي‏شود. و (گلايسين، سيستئين)حذف خواهند شد. سيستئين ايجاد پيوند سولفيدي در زنجيره مي‌کند. و باعث تغييرات فيزيکي و شيميايي پروتئين مي‌شوند.
5-2-3- آناليز و بررسي جهش‌هاي ايجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ايزوله شماره 35:
Alignment ،سکانس ompP2 ايزوله باليني شماره 35 با، (AY579215. 1) با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني، 93% شباهت دارد. از مقايسه اين ايزوله با موارد ثبت شده درNCBI، جهش‌هاي زير در بازهاي اين ايزوله مشاهده شد. با تغيير در اين باز‏ها، سايت برش متفاوت با آنزيمAlu1 به وجود آمده است
A42G43C44T45 —-
A60G61C62T63 —-
AG895C896T ACTT
A910G911C912T913 CGTT
AA589G590T AGCT
در اين پروتئين، تبديل آلانين به گلايسين را مشاهده مي‌کنيم. با از بين رفتن بار مثبت آلانين و جايگزيني آن با اسيد آمينه کوچک گلايسين ايجاد تغيير در زنجيره مي‌کند. و همچنين مشاهده ميکنيم، سيستئين حذف شده و يا به اسيد آمينه ‌هاي ديگر تبديل شده که با از بين رفتن پيوند دي سولفيدي باعث تغيير مي‏شود. و آلانين اضافه شده به زنجيره اسيدآمينه ‏اي که باعث اضافه شدن بار مثبت به زنجيره مي‏شود. همه اين تغييرات باعث ايجاد تغيير در پروتئين مي‌شوند.
5-2-4- آناليز و بررسي جهش‌هاي ايجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ايزوله شماره 14:
Alignment ،سکانسompP2 ايزوله باليني شماره 14 با، (M93270. 1) با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني، 99% شباهت دارد. از مقايسه اين ايزوله با موارد ثبت شده درNCBI، هيچ جهش جديدي که منجر به تغيير سايت برش آنزيمAlu1 شود مشاهده نشد.
A42G43C44T45 —-
A60G61C62T63 —-
در اين پروتئين نيز تبديل ترئونين به سيستئين باعث ايجاد يک پيوند دي سولفيدي در زنجيره مي‏شود. همچنين ترئونين به آلانين تبديل شده که آلانين به علت بار مثبتي که به خاطر (NH+) دارد باعث ايجاد تغيير مي‏شود. همچنين يک حذف شدگي آلانين و سيستئين داريم. و در سه جا اضافه شدن گلايسين را داريم که همگي باعث تغييرات فيزيکي و شيميايي در پروتئين مي‌شوند.
5-2-5- آناليز و بررسي جهش‌هاي ايجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ايزوله شماره 47:
Alignment ،سکانس ompP2 ايزوله باليني شماره 47 با (AY051399. 1) با اطلاعات ثبت شده در بانک ژني، 98%شباهت دارد. از مقايسه اين ايزوله با موارد ثبت شده در NCBI، هيچ جهش جديدي که منجر به تغيير سايت برش آنزيمAlu1 شود مشاهده نشد.
A42G43C44T45 —-
A60G61C62T63 —-
در اين پروتئين ما يک تيروزين تبديل به هيستيدين شده است که تيروزين داراي حلقه هست و هيستيدين يک اسيد آمينه با ريشه بازي مي‌باشد و يک گلايسين به گلوتاميک اسيد تبديل شده جابه جايي يک اسيد آمينه کوچک بدون زنجيره جانبي با يک اسيد آمينه بزرگتر با ريشه اسيدي، يک آسپاراژين به تيروزين باعث ايجاد يک حلقه در زنجيره و اشغال فضاي بيشتر در زنجيره به همراه بي نظمي‌ در آرايش پروتئين، اضافه شدن يک پرولين که ايجاد يک خميدگي در زنجيره مي‌کند و تبديل آرژنين به گلايسين که حذف يک اسيد آمينه بازي و بزرگ و ايجاد يک اسيد آمينه کوچک، مي‌توانند باعث تغييرات فيزيکي و شيميايي بسياري در پروتئين شوند.
بايد توجه داشت، تغييرات اسيدآمينه به يکديگر در گروه‌هاي مختلف، باعث تغيير در شکل گيري پروتئين و بالطبع تغيير جايگاههاي اپي توپ و به دنبال آن باعث تغيير ايمنوژنسيته پروتئين مي‏شود.
5-3- بحث:
بر اساس گزارش سازمان بهداشت جهاني، ميزان مننژيت H. influenza در منطقه مديترانه شرقي بين 59. 9-15 در هر 100000 نفر کودک زير پنج سال مي‌باشد. در اين گزارش، ميزان بروز مننژيت H. influenza در ايران، 4. 7-3. 5 در هر 100000نفر در سال مي‌باشد.
مطالعه دکتر البرزي در شيراز (1380-1378) و مطالعه‏ي سازمان بهداشت جهاني در 6 استان کشور (1385-1383)، شيوع مننژيت هموفيلوس در کودکان زير 5 سال، به ترتيب 2. 8و 3. 55 در هر 100000 نفر در سال گزارش کرد (Roche&Maxon, 1995).
چندين واکسن موثر در

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید