کننده DNA در آنها بسيار پلي مورفيسم مي‌باشد (Forbes&el, 1992) .
Sanders J. D و همکارانش، در سال 1993 در دالاس ژن ompP2(NTHi) را به ompP2(Hib) جهش يافته غيربيماريزا انتقال دادند و باعث ترميم ژن Hib شد و دوباره توانايي پاتوژن مانند سويه وحشي خود را بدست اورد. اين نتايج نشان مي‌دهد که ژن پروتئين ompP2(NTHi) ميتواند در غشاي خارجي Hib بيان شود و به طور درست عمل کند (Sanders&el, 1993).
Hiltke Tj و همکارانش، در نيويورک سال 2002، ژن (ompP2) ،13نمونه بيمار مبتلا به بيماري انسداد مزمن ريوي را تعيين توالي کردند. در 9 نمونه، تغييري وجود نداشت. در 4 نمونه ،تغيير وجود داشت. بسياري از اين تغييرات در حوزه‌هايDNA تکراري رخ داده است. که اين نوع DNA نقش مهمي‌ در تنوع آنتي ژني ompP2 نشان ميدهد. توالي ompP2 در ميزبان انساني نسبتا پايدار است. P2، علاوه بر اپي توپ‌ هاي متغير اپي توپ‌هاي حفاظت شده دارد که مي‌تواند کانديد واکسن باشد. (Hiltke, 2001)
Hiltke Tj و همکارانش، در نيويورک سال 2003، با مطالعه بر روي يک بيمار مبتلا به انسداد ريوي به مدت دو سال با استفاده از PFGE و تجزيه و تحليل توالي ompP2، انتقال افقي ompP2 بين دو سويه در دستگاه تنفسي را نشان داد.مشاهده انتقال افقي ompP2، در دستگاه تنفسي انسان داراي پيامدهاي مهم براي درک تنوع ompP2 در ميان سويه‏ها و طراحي واکسن بر اساس ompP2 دارد. (Mandell et al, 2010, P. 1079-1171)
هدف اين تحقيق، اپيدميولوژي مولکولي ompP2 در سويه‌هاي هموفيلوس آنفلوانزاي جدا شده از نمونه‌هاي باليني است. در ايران مطالعات اپيدميولوژي روي سويه‌هاي هموفيلوس آنفلوانزا به ندرت انجام شده و بخصوص از پروتئين P2 هيچگونه اطلاعاتي نداريم و با توجه به اهميت پروتئين مذکور به عنوان جانشيني واکسن Hib وNTHi و سياست‌هاي کلي وزارت بهداشت و درمان و اموزش پزشکي در خصوص گنجاندن واکسن بر عليه هموفيلوس آنفلوانزا در برنامه واکسيناسيون کشوري اينگونه مطالعات روي سويه‌هاي بومي ‌انجام شود. با توجه به اينکه در دنيا و همچنين ايران هنوز واکسن مناسبي براي سويه‌هاي NTHi وجود ندارد لذا نياز به داشتن اطلاعات در مورد پلي مورفيسم احتمالي ژن پروتئين ompP2 داريم. زيرا اگر اين تغييرات زياد باشند، بالطبع اين پروتئين کارايي لازم را جهت پوشش دادن سويه‌هاي متعدد هموفيلوس آنفلوانزا را نخواهد داشت.

فصل سوم:
روش شناسي

3-1- مواد و وسايل:
* سمپلرهاي 0. 2 تا 2 و 2 تا 20 و 100 تا 1000 ميکروليتري
* سر سمپلر
* ميکروتيوپ‌هاي 0. 2 و 0. 5 و 1. 5 ميلي ليتري قابل سانتريفيوژ
* کرايوتيوپ‌هاي 2 ميلي ليتري
* سرنگ‌هاي 2 و 5 و 10 ميلي ليتري
* پتري ديش‌هاي باکتريولوژيکي 100 ميلي متري
* لام
* لامل
* سواپ استريل
* پيپت
* قطره چکان
* محيط کشت شکلات اگار
* سرم فيزيولوژي
* آگارز
* محلول TBE
* اتيديوم برومايد
* رنگ کريستال ويوله
* رنگ لوگول
* رنگ فوشين
* الکل استون
* اتانول
* آب مقطردوبار تقطير
* ماسک
* اسيدبوريک
* EDTA
* Trace
* دستکش لاتکس
* چسب اتوکلاو
* يخ
* لوله شيشه‏اي سانتريفيوژ
* ويال استريل 10 سي سي و 50 سي سي
* پنبه
* ميکروپليت
* سرم فيزيولوژي اپيروژن
* بافر PBS(Ph:7/2)
* فنل
* آب مقطر دوبار تقطير شده
* اتانول مطلق Merck
* متانول
* ايزوپروپانول
* تري کلرو استيک اسيد (T. C. A)
* EcoR1
* EDTA
* اتيديوم برومايد
* تريس بافر بازي
* آنزيمAlu1
* Mastermix
3-2- دستگاه ها:
* دستگاه PCR
* دستگاه الکتروفورز
* دستگاه Gel Documentation
* دستگاه اسپکتروفوتومتر
* ميکروسکوپ نوري
* يخچال 4 درجه
* فريزر 20- درجه
* فريزر 80- درجه
* دستگاه سانتريفيوژ
* شيکر
* دستگاه اسپکتروفوتومتر
* انکوباتور 37 درجه CO2دار
* هود بيولوژيک
* هود شيميايي
* ترازوي ديجيتالي حساس
* شعله گاز
* تانک الکتروفورز
* مايکروويو
* نرم افزار MEGA4
* هيتر
* اتوکلاو
3-3- محلول سازي:
3-3-1- آماده سازي محيط کشت:
اولين گام در تهيه محيط کشت براورد ميزان کل محيط کشت مورد نياز است. اين مقدار از تعداد ظروف کشت و حجم مورد نياز محيط به ازاي هر ظروف به دست آمد. معمولاً براي هر پليت با اندازه متوسط، 20 ميلي ليتر محيط در نظر گرفته شد. مطابق دستور کارخانه سازنده، مقدار محيط لازم از محيط کشت را، که به صورت پودر است توزيع و سپس با مقدار توصيه شده آب مقطر داخل ارلن، مخلوط شد. براي توزين پودر با قرار دادن يک تکه کاغذ تميز برروي ترازو و کاليبره(23صفر)کردن آن،به آرامي‌ با يک قاشک تميز و خشک، پودر را روي کاغذ ريخته و وزن آن را سنجيده شد. آب مقطر را در يک مزور ريخته و حجم دقيق آن اندازه گيري شد. براي اين که پودر به کف ارلن نچسبد و در هنگام حرارت دادن نسوزد، ابتدا مقداري از آب مقطر را در ارلن ريخته و سپس پودر به آن افزوده شد. (معمولاً حجم ارلن بايد دو برابر حجم محلول محيط کشت باشد تا در زمان حرارت دادن و به جوش آمدن، سر ريز نگردد). هم زمان با تکان دادن ارلن، بقيه آب مقطر نيز افزوده مي‏شود.
براي انحلال کامل اگار، بايد محلول را حرارت داد. به اين منظور با قرار دادن يک توري شعله پخش کن بر روي شعله و يااستفاده از هيتر24ارلن حاوي محيط کشت به آرامي‌حرارت داده شد (تا زماني که محيط بجوشد اما کف نکند و سرريز نشود). بهترين روش براي جلوگيري از ته گرفتن محيط کشت، قرار دادن آن در بن ماري جوش است. حرارت دادن تا شفاف شدن کامل محلول ادامه يافت. سپس دهانه ارلن را با پنبه پوشانده و پنبه با فويل الومينيومي‌ محکم شد. (اگر هدف تهيه محيط کشت مايع باشد به حرارت دادن نيازي نيست. در اين صورت، محيط در حجم‌هاي مورد نظر در لوله‌هاي آزمايش سترون تقسيم و درب لوله‏ها با درپوش يا پنبه مسدود مي‏شود. براي جلوگيري از پريدن پنبه‏ها سر لوله‏ها با کاغذ پوشانده مي‏شود.) سپس ارلن يا لوله‌هاي حاوي محيط کشت را در اتوکلاو به مدت 15 دقيقه در دماي 121 درجه سانتي گراد قرار داده تا سترون شد.
بعضي از محيط‌هاي کشت را، که به دماي بالا حساس‏اند نمي‌توان در اتوکلاو قرار داد. روش سترون سازي اين قبيل محيط‏ها توسط کارخانه سازنده بيان شده است.
3-3-2- محيط شکلات اگار:
در ساختن اين محيط از پايه اگار خوندار استفاده شد. پس از آماده نمودن و استريل کردن محيط پايه گلبول‌هاي قرمز هنگامي‌که هنوز محيط داغ است(در حدود 85 درجه سانتيگراد) به آن اضافه شد. گلبول‌هاي قرمز در حالت ليز شده و محيط رنگ شکلاتي -قهوه‏اي به خود گرفت. (اکنون هموگلوبين و ساير مواد مغذي موجود در گلبول‌هاي قرمز در محيط وجود دارند) بايد همين25 که فاکتور X خوانده مي‏شود، و کوآنزيم نيکوتين اميد ادنين دي نوکلئوتيد26 (NAD) که فاکتور V خوانده مي‏شود، به عنوان مکمل به محيط پايه اگار غني از مواد مغذي اضافه گردند. نايسريا گنوره و گونه‌هاي هموفيلوس در ميان ساير ارگانيسم‌هاي سخت رشد، رشد بهتري در حضور مواد مغذي مکمل اضافه شده به شکلات اگار دارند. (Esmaily et al, 2011)

3-3-3-آماده سازي ژل اگارز 1 درصد:
ژل مورد استفاده در اين تحقيق، با توجه به طول قطعات حاصل از PCR، 1%بود. با در نظر گرفتن درصد ژل، ميزان لازم پودر اگارز محاسبه شده و پس از وزن کردن با ميزان مناسب از بافر TBE1x در داخل بشر مخلوط گرديد.
براي تهيه 100 ميلي ليتر محلول ژل اگارز 1 درصد، مقدار 1 گرم از پودر اگارز با 100 سي سي از بافر TBE 1 x مخلوط گرديد. (Janson et al, 1993 Tibor, A. 1995 😉 پس از آماده شدن اين مخلوط، در مايکروويو قرار داده شد تا محلول جوشيده و شفاف گردد. سپس تا دماي 45 تا 50 درجه خنک کرده و چند قطره اتيديوم برومايد27 به آن اضافه گرديد. (; Larson et al, 1986 Janson et al, 1993)سپس اين مايع داخل cast28 ريخته مي‏شود که از قبل شانه مناسب با توجه به تعداد چاهک‌هاي مورد نياز در داخل آن قرار داده شده بود. پس از گذشت مدت زمان مناسب (حدود 15 دقيقه) ژل بسته شده و جامد گرديد (از حالت بي رنگ به صورت شيري رنگ در آمد). پس از اينکه کاملاً سفت شد شانه را به آرامي، به طوري که چاهک‏ها را پاره نکند از ژل به تانکي منتقل شد که حاوي TBE با همان درصد و غلظت بافر استفاده شده در ساخت ژل بود. (Meyers et al, 1976; Inoshima et al, 2000)
3-4- طراحي و روش اجرا:
3-4-1- جمع‏آوري نمونه:
نمونه‏ها از بيماران مختلف مراجعه کننده به مرکز طبي کودکان بيمارستان امام و بيمارستان ميلاد جمع‏آوري و مورد بررسي قرار گرفت (Doran et al, 2003, P175-186).
3-5- کشت نمونه ها:
از مهمترين روشهاي تشخيصي در باکتري شناسي کشت و تکثير باکتري‏ها در محيط‌هاي مصنوعي است. مواد غذايي، حرارت، رطوبت کافي، pH، نمک، حضور يا عدم حضور اکسيژن از جمله شرايط مناسب براي رشد باکتري هستند. (50) سويه‌هاي هموفيلوس آنفلوانزاي ايزوله شده از نمونه‌هاي باليني بااستفاده از لوپ آزمايشگاه و يا سواپ استريل به صورت يکنواخت روي محيط شکلات اگار در زير هود بيولوژيک با رعايت تمام نکات ايمني کشت داده شد. دماي مناسب براي رشد هموفيلوس آنفلوانزا، 37 درجه سانتيگراد و زمان لازم 24 تا 48 ساعت مي‌باشد و اين باکتري براي رشد نياز به CO2 دارد. به همين خاطر محيط‏ها پس از کشت به مدت 24 ساعت درون انکوباتور CO2 دار و دماي 37 درجه قرار داده شده اند. (Stellwagen,E& N. C. Stellwagen,2002)
3-6- تست‌هاي بيوشيميايي:
براي تاييد حضور و رشد هموفيلوس انفوانزا از تست‌هاي بيوشيميايي اکسيداز و کاتالاز، اوره آز، ايندول، اورنيتين دکربوکسيلاز استفاده مي‏شود .(Ahren et al, 2001)
براي تست اکسيداز از ديسک اکسيداز استفاده شد. مقدار بسيار کمي ‌از نمونه با استفاده از لوپ سوزني روي ديسک قرار داده شد. (تغيير رنگ ديسک از سفيد به آبي، نشان دهنده مثبت بودن تست مي‌باشد. )
براي تست کاتالاز، يک قطره پراکسيد هيدروژن روي آن قرار داده شد و مقدار کمي‌نمونه با استفاده از لوپ سوزني با آن مخلوط گرديد. (در صورت مشاهده جوشش و پيدايش حباب‌هاي ريز، نتيجه مثبت خواهد بود (Snow,J. B, 2002).

شکل3-1-تست کاتالاز
ايندول که محصول نهايي تجزيه تريپتوفان به وسيله آنزيم تريپوفاناز مي‌باشد رامي‌توان به وسيله توانايي ترکيب آن با برخي از الدهيدها و تشکيل يک ماده رنگي مشخص نمود. ارگانيسم‌هاي ايندول منفي، بدون تغيير رنگ باقي مي‌مانند. (Alrawi et al, 2002)
براي تست اوره حدود 5 الي 10 ميلي ليتر از محيط کشت را در لوله زمايش ريخته و به طور عمودي مي‌گذارند تا محيط بسته شود. ميکروارگانيسم‏ها را توسط انس به طور عميق در مرکز اين محيط کشت داده شد (ايجاد رنگ قرمز نشان دهنده واکنش قليايي و هيدروليز اوره مي‌باشد. (Esmaily et al, 2011)
3-7- رنگ آميزي:
با استفاده از رنگ آميزي گرم نمونه از نظر موفولوژي بررسي مي‏شود. ابتدا در کنار شعله از محيط کشت 24 ساعته برداشته و درون يک قطره سرم فيزيولوژي بر روي لام حل مي‌کنيم. سپس با استفاده از شعله نمونه را فيکس مي‌کنيم. ابتدا کريستال ويوله را بر روي نمونه ميريزيم پس از يک دقيقه با آب مقطر شستشو داده بعد لوگول به مدت 1 دقيقه و شستشو باآب مقطر، الکل استون، 10 ثانيه دوبار شستشو، فوشين، 30 ثانيه و در نهايت با آب مقطر شستشو داده و پس از خشک شدن با ميکروسکوپ نوري مشاهده مي‌کنيم. (رنگ آميزي گرم، باکتري به شکل باسيل گرم منفي ديده مي‏شود.)(شکل3-2)

شکل 3-2- شکل باسيل گرم منفي هموفيلوس آنفلوانزا
3-8- نگهداري ايزوله‌هاي باليني هموفيلوس آنفلوانزا در

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید