برابر استرين‌هايHib ساخته شده است، اما اين واکسن‏ها نمي‌توانند کودکان را در برابر عفونت‌هاي مرتبط با NTHi حفاظت کنند. براي توسعه يک واکسن موثر بر عليه Hib و NTHi، مطالعه زيادي روي چندين پروتئين سطحي همچون پيلي و پروتئين‌هاي غشاي خارجي (OMP) انجام گرفته است. با معرفي واکسن‌هاي کونژوگه، شيوع بيماري‌هايHib به شدت کاهش پيدا کرد و به جاي آن بيماري‌هاي NTHi افزايش پيدا کرد. بر طبق اطلاعات اتحاديه اروپا ميزان شيوع Hib در طول سال‌هاي 2000 تا 2004 به ترتيب 50، 1، 14، 2، 27، 2، 24، 1، 11، 1 در هر ميليون از جمعيت و در همان زمان شيوع بيماري‌هاي NTHi به ترتيب 33، 65، 2، 2، 99، 1، 52، 2، 33، 2، مي‌باشد. ( 39، 9).اگر چه ميزان شيوع بيماري‌هاي NTHi به اندازه Hib قبل از واکسيناسيون نيست، اما ميزان شيوع و توزيع آنها در سال‌هاي گذشته افزايش يافته است و همچنين سن بيماراني که از بيماري‌هاي تهاجمي‌ هموفيلوس آنفلوانزا رنج مي‌برند، تغيير شيفت از کودکان زير 12 سال به سمت بالغين داشته است .(Dworkin et al, 2007)
پروتئين غشاي خارجي P2 اولين بار توسط Munson و همکارانش در سال 1992شناسايي و خالص شد. آنها توانستند درجه بالايي از حفاظت شدگي ژن ompP2 را در ميان گونه‌هاي سويه Hibهموفيلوس آنفلوانزا را نشان بدهند (Sikkema&Murphy, 1992).
Sikema و همکارانش، در سال1992 در نيويورک در سويه‌هاي بدون کپسول و کپسول دار هموفيلوس آنفلوانزا نشان دادند که سويه Hib بسيار حفاظت شده است اما سويه‌هاي بدون کپسول هتروژنسيته مي‌باشند. آنها از بررسي سه سويه NTHi، 4 ناحيه )12 تا 35 اسيدآمينه ‏اي ( و چندين ناحيه کوچکتر (2 تا 7 آمينو اسيدي) خيلي متغير را شناسايي کردند. 4 ناحيه خيلي متغير شاملV1 (آمينو اسيد شماره 85-115)، V2 (175-209)، V3 (226-255)، V4 (363-374) بودند که همه اين 4 ناحيه در قسمت سطح بيروني پروتئين قرار دارند. آنها گزارش کردند که در توالي پروتئين P2 هموفيلوس آنفلوانزاHib آمينواسيدهاي (181 تا 188) در omp ساب تايپ‌هاي (2L و6U) با آمينو اسيد سويه MinnA (ساب تايپ 1H) متفاوت مي‌باشند، که اين تغيير با قسمت V2 در NTHi يکسان مي‌باشد. و همچنين تفاوت در مناطق متغير باعث تفاوت در جرم مولکولي و تفاوت آنتي ژني در پروتئين P2 مي‏شود (Niazi , 2009).
در سال 1993، Brigitta Duimو همکارانش در آمستردام نشان دادند که (نه) ناحيه بسيار حفاظت شده با تفاوت بازهاي بسيار کمي‌ در بين هشت ناحيه‏ي متغير قرار گرفته اند. (سه) ناحيه با اندکي تفاوت يافت شدند. که ناحيه1 (نوکلئوتيدهاي 123-189) و ناحيه 3(نوکلئوتيدهاي 403-459)در سر /5 و يک ناحيه 7 (نوکلئوتيدهاي 967-1005)در سر /3 قرار دارند. و پنج ناحيه با توالي خيلي متغير يافت شدند که از قبيل ناحيه2(نوکلئوتيدهاي 264-315)، ناحيه 4 (نوکلئوتيدهاي 532-588)، ناحيه 5 (نوکلئوتيدهاي 667-738)، ناحيه 6 (نوکلئوتيدهاي 805-891) و ناحيه 8 (نوکلئوتيدهاي 1075-1126) مي‌باشند. در اين ناحيه‏ها، حذف يا اضافه يا جابه جايي نوکلئوتيدها وجود دارد. به علاوه ناحيه4 (از نوکلئوتيد 532-588) هموفيلوس آنفلوانزا سويه B 3230 وA930010 داراي نواحي غني از ( GوT ) بودند. و هموفيلوس سويه‌هايd1 وt1 غني از (CوA) بودند. و اين تغييرات در توالي آمينواسيدي اين پروتئين، در هشت ناحيه مختلف ديده مي‌شوند. که پنج ناحيه بسيار متغيرند. 4 ناحيه‏ي بسيار متغير، ناحيه2 (اسيد آمينه 69-85)، ناحيه 4 (اسيدآمينه 158-176) ناحيه 5 (اسيدآمينه 203-226) و ناحيه 6 (اسيد آمينه ‌هاي 249-277) که در وسط پروتئين قرار گرفته‏اند و ناحيه 8 (اسيد آمينه ‌هاي 339-355) که در سر C ترمينال قرار گرفته است. هر گونه حذف يا اضافه شدن اسيد آمينه ‏ها در اين ناحيه‌هاي بسيار متغير باعث تغيير اندازه لوپ‏ها مي‏شود ( Duim B, 1993).
Groeneveld و همکارانش ،در سال 1992 نشان دادند که ايمن سازي خرگوش‏ها با باکتري‌هاي سالم منجر به توليد آنتي بادي‌هاي ضد P2 که تنها در برابر اين سويه‏ها مصون بودند شد.
(Sikkema&Murphy, 1992)
Neary و همکارانش ،در برزيل نشان دادند که ميزان آنتي بادي‌هاي خاص به لوپ 6، پروتئينP2 خيلي بالاست .و پروتئين P2 براي واکسن يک کانديداي مناسب هست. (Varela et al, 2012)
Murphyو همکارانش ،در سال 1989 پورين پروتئين P2 را براي تهيه واکسن پيشنهاد دادند. (Niazi, 2009)
Munson و همکارانش، در سال 1989 با استفاده از SDS ژل الکتروفورز نشان دادند که پروتئين P2 در سويه هموفيلوس آنفلوانزاHib داراي وزن مولکولي مشخصي بين 37-40 کيلو دالتون مي‌باشد. Martin, D et al 1991) )
Forbes. kj و همکارانش، در سال 1992 در انگليس نشان دادند که درسويه‌هاي بدون کپسول هموفيلوس آنفلوانزا بر عکس سويه کپسول دار Hib، اندازه پروتئين P2 وابسته به طول ژن مي‌باشد و توالي کد کننده DNA در آنها بسيار پلي مورفيسم مي‌باشد .(Forbes&el, 1992)
Sanders j. D و همکارانش، در سال 1993 در دالاس ژن ompP2 (NTHi) را به ompP2 (Hib) جهش يافته غيربيماريزا انتقال دادند و باعث ترميم ژن Hib شد دوباره توانايي پاتوژن مانند سويه وحشي خود را بدست اورد. اين نتايج نشان مي‌دهد که ژن پروتئين ompP2 (NTHi) ميتواند در غشاي خارجي Hib بيان شود و به طور درست عمل کند . &el, 1993) (Sanders
Hiltke Tj و همکارانش، در نيويورک سال 2002، ژن ompP2 (13) نمونه بيمار مبتلا به بيماري انسداد مزمن ريوي را تعيين توالي کردند.در 9 نمونه تغييري وجود نداشت. در 4 نمونه تغيير وجود داشت. بسياري از اين تغييرات در حوزه‌هاي DNA تکراري رخ داده است. که اين نوع DNA نقش مهمي‌ در تنوع آنتي ژني ompP2 نشان ميدهد. توالي ompP2 در ميزبان انساني نسبتا پايدار است. P2، علاوه بر اپي توپ‌هاي متغير اپي توپ‌هاي حفاظت شده دارد که مي‌تواند کانديد واکسن باشد. (Hiltke, 2002)
Hiltke Tj و همکارانش ،در نيويورک سال 2003، با مطالعه بر روي يک بيمار مبتلا به انسداد ريوي به مدت دو سال با استفاده از PFGE و تجزيه و تحليل توالي ompP2، انتقال افقي ompP2 بين دو سويه در دستگاه تنفسي را نشان داد . مشاهده انتقال افقي ompP2، در دستگاه تنفسي انسان داراي پيامدهاي مهم براي درک تنوع ompP2 در ميان سويه‏ها و طراحي واکسن بر اساس ompP2 دارد .(Hiltke&el, 2003)
هموفيلوس آنفلوانزا از مهمترين علل عمده عفونت‌هاي مننژيت باکتريايي و ساير عفونت‌هاي مهاجم در کودکان کمتر از 4 سال مي‌باشد. از زمانيکه واکسيناسيون عليه سويه هموفيلوس آنفلوانزا، وديگر سروتايپ‏ها و سويه‌هاي Nontypeable آن از عوامل مهم بيماري‏ها مي‌باشند. پورين پروتئين ompP2 از عمده پروتئين‌هاي غالب غشاي خارجي هموفيلوس آنفلوانزا مي‌باشد، و هتروژنسيته آنتي ژني گسترده‏اي در ميان سويه‏ها نشان مي‌دهد (Hiltke, 2002). بيشتر سويه‌هاي هموفيلوس آنفلوانزا دچار جهش آنتي ژني شامل تغييرات دائمي‌ در توالي اسيد آمينه و بعضي ساخنارهاي ايمني مهم و اپي توپ‏ها مي‌شوند. اين توضيح بهتر در پروتئين غشائ خارجي P2 (که به شدت ايمني است)شرح داده شده است. اگر چه بخش‌هايي از اين پروتئين که در معرض سطح خارجي غشا هستند، تنوع زيادي را در بين گونه‌هاي مختلف هموفيلوس آنفلوانزا دارند، اما لوکوسهاي ژنتيکي کد کننده پروتئين P2 موتاسيون و تنوع ژنتيکي چنداني را نشان نمي‌دهند. هر چند که برخي از نواحي تکراري در ژنوم اين پروتئين اندکي با يکديگر متفاوت اند.
.(Niazi, 2009) تاکنون واکسني که عليه تمام عفونت‌هاي هموفيلوس آنفلوانزا بتواند عمل کند طراحي نشده است، بنابراين ضرورت معرفي يک پروتئين بسيار حفاظت شده و ايمونوژنيک مطرح مي‏شود. لذا بر آن شديم تا با بررسي‌هاي مولکولي يکي از پروتئين‌هاي ايمونوژنيک در اين باکتري، که در مطالعات گذشته به عنوان کانديد مناسب گزارش شده بود را در سويه‌هاي باليني ايران نيز ميزان حفاظت شدگي آن مورد آناليز قرار گيرد تا گامي‌ در جهت طراحي واکسن عليه اين سويه‌هاي پاتوژن بومي ‌برداشته شود. بررسي پلي مورفيسم ژن ompP2 توسط RFLP از 30 ايزوله باليني و شناسايي و تعيين اختلافات سکانس‏ها مي ‌باشد که باعث هتروژنسيتي ايمني در سطح پروتئين مي‏شود. در اين مطالعه ما سکانس DNA ساختمان ژن ompP2 را در 6 ايزوله مورد بررسي قرار داديم. سکانس نوکلئوتيدها با سکانس نوکلئوتيدي ثبت شده در NCBI، Alignment و بعد مقايسه شدند. در نمونه شماره 3، در دو ناحيه (نوکلئوتيدهاي شماره (897-909) و نوکلئوتيدهاي شماره (916 -929)به توالي نوکلئوتيدي اضافه شدند. و در باقي نواحي تغيير نوکلئوتيد و 13 نوکلئوتيد حذف شده مشاهده مي‏شود. در نمونه شماره 5، فقط در دو ناحيه (نوکلئوتيد 709-710) و (نوکلئوتيد 722-724) حذف ديده مي‏شود. و در تعداد بسيار کمي ‌تغييرات مشاهده مي‏شود.
در نمونه شماره 8، نوکلئوتيدهاي شماره (1181-1189) تغيير کرده اند. و در تعداد اندکي نوکلئوتيد تغيير مشاهده مي‏شود. در نمونه شماره 35 نوکلئوتيدهاي شماره (274-275)، (709-710)، (717-718)، (766-767)، (1112-1113)حذف مشاهده مي‏شود و تعدادي نوکلئوتيد تغيير مشاهده مي‏شود. نمونه‌هاي شماره (14 و 47 )، 99%شبيه با سويه‌هاي استاندارد بودند.
اين يافته‏ها نشان داد که ژن P2 omp از نظر آنتي ژنيک و عملکردي در بيشتر مناطق حفاظت شده مي‌باشد و سازماندهي ژن ompP2 بسيار شبيه استرين‌هاي هموفيلوس آنفلوانزا متعلق به سروتايپ و بيوتايپ‌هاي مختلف ساير کشورها مي‌باشد.
طبق بررسي‌هاي انجام شده، پيشنهاد مي‌شود که به منظور توليد واکسن، يکي از بهترين انتخاب‏ها، پروتئين P2 هموفيلوس آنفلوانزا است. زيرا وجود اين پروتئين در هر دو سويه Typeو Nonetype هموفيلوس آنفلوانزا حفاظت شده مي‌باشد و همچنين اين پروتئين در سويه Hib کاملاً حفاظت شده است و در سويه‌هاي Nonetype نيز علاوه بر بخش‌هاي متغير داراي بخش‌هاي حفاظت شده مي‌باشد که مي‌توان از آنها به عنوان کانديداي واکسن استفاده کرد. با توجه به اينکه واکسن فعلي با استفاده از PRP ساخته مي‏شود ،بعلت جنس پلي ساکاريدي اين آنتي ژن، در بدن افراد و بخصوص کودکان زير 2 سال، ايمني فعال ايجاد نمي‌کند. همين طورPRP آنتي ژن مختص سويه‌هاي کپسول دار به حساب مي‌آيد. اما آنتي ژن‌هاي پروتئيني همان طور که بيان نموديم قادر به ايجاد ايمني فعال وابسته به لنفوسيت T در تمام سويه‌هاي باکتري هستند.

پيشنهادات:
1-در سويه‌هاي بيشتري از هموفيلوس آنفلوانزا پلي مورفيسم ژن ompP2 بررسي شود.
2-بيان ژن پروتئين P2 توسط تکنيک Real time PCR بررسي شود.
3-مطالعات بي زياني و توکسيسيتي پروتئين P2 روي مدل‌هاي حيواني انجام شود و سپس وارد فازهاي باليني گردد.
4-در مدلهاي حيواني، ارزيابي ايمونولوژيکي پروتئين P2 انجام شود.
5-بر روي انواع سروتايپ اين باکتري، آناليز مولکولي اين ژن انجام شود.
6-تکرار اين مطالعه با تعداد بيشتري سويه باليني که از نقاط مختلف کشور ايزوله مي‌شوند صورت بگيرد.
7-بهره گيري از تکنيک‌هايي همچون تکنيک
LAMP (Loop-mediated isothermal amplification of DNA) براي نواحي بسيار حفاظت شده اين ژن، مي‌تواند کمک موثري در اهداف تشخيصي فراهم کند.

منابع

فهرست منابع

References:
1- Ahren,l. L. ,H. Janson ,et al. (2001)Protein D expression promotes the adherence and internalization of non-typeable Haemophilus influenza into human monocytic cells. Microbial Pathogenesis 31(3):151-158.
2- Alrawi, A. M., K. C. Chern, el al. (2002). Biotypes and serotypes of

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید