آنها
ستون
تري‌متيل
هگزيل
اکتيل
اکتادسيل
دکوسيل
ميزان قطبيت
C(3)
C(6)
C(8)
C(18)
C(22)

ستون‌هاي اكتادسيل سيلان متداول‌ترين ستون‌هاي مورد استفاده هستند و معمولاً بهترين انتخاب براي آناليز تركيبات غيرقطبي ناشناخته هستند. اين نوع ستون يك فاز بسيار غيرقطبي است و در چنين ستوني مواد قطبي سريعتر از مواد غيرقطبي شسته مي‌شوند. اگر مواد مورد آزمايش قطبي باشند يك ستون C8 قابل استفاده‌تر از ستون C18 است.
در انتخاب ستون بايد از فاكتورهايي تبعيت كرد كه عبارتند از:
بازنگري اطلاعات به دست آمده از آزمايش‌هاي قبلي روي همان ماده.
استفاده از دانش ساختار شيميايي موادي كه بايد جدا شوند.
مراجعه به متون مختلف براي كسب اطلاعات بيشتر، براي مثال در كاتالوگ سازنده دستگاه اطلاعات بسياري وجود دارد كه مي‌توان از آن استفاده كرد.
با انجام يك آزمايش نمونه مي‌توان مشخص كرد كه ستون انتخاب شده عملكرد رضايت‌بخشي دارد يا نه.
مشخصات ستون
وقتي كه نوع فاز انتخاب گرديد، مشخصات مهم ديگري هم براي ستون وجود دارد كه مي‌تواند در نتيجه آزمايش تأثير داشته باشد. حتي اگر نبايد در مورد انتخاب ستون تصميم‌گيري كنيد، دانستن بعضي از خصوصيات اصلي ستون كه در كنترل جداسازي نقش دارند ضروري مي‌باشد. برخي از معيارهاي متداول براي پارامترهاي ستون در جدول 3-4 آمده است.
جدول ‏3-4: طول و قطر داخلي ستون
نوع ستون
قطر داخلي (mm)
حجم تزريق
سرعت جريان
ستون‌هاي متداول
6/4
20-5
2000-500
قطر باريك
2
5-1
200
قطر ميكرو
1
2-5/0
50
موثينه
5/0
1/0
5
جريان نانو
05/0
nL
1/0
طول ستون‌ها معمولاً cm15 و قطر داخلي آنها mm6/4 است. اما ستون‌هايي با قطر داخلي و طول ديگر هم وجود دارند. ابعاد ستون عبور جريان و مقدار نمونه تزريق شده را تعيين مي‌كند و تأثير زيادي بر زمان انجام يك آزمايش دارد.
معمولاً براي انجام سريع‌تر آزمايش (زمان كوتاهتر) از ستون‌هاي با طول كمتر (cm5-3) و قطر داخلي كوچكتر (mm2-1) استفاده شود.
استفاده از ستون‌هاي موثينه (با قطر داخلي در محدوده 300-180) هرچه بيشتر روبه افزايش است زيرا از يك طرف آزمايش سريعتر انجام مي‌شود و از طرف ديگر به دليل مصرف حلال كمتر، ارزان‌تر است.
‌آشكارساز فرابنفش (UV)
آشكارسازي‌هاي فرابنفش به دليل قابليت استفاده زياد، براي آناليز بسياري از تركيبات آلي مورد استفاده قرار مي‌گيرند. همچنين به دليل سادگي در اجراي آزمايش، متداول‌تر از ديگر آشكارسازها هستند. تصوير مقطعي از سل جريان فرابنفش آمده است.
وقتي اجزاء نمونه جاذب فرابنفش از ستون وارد مسير نوري سل جريان مي‌شود، تابش فرابنفش جذب شده و يك علامت كاهش يافته در آشكارساز ايجاد مي‌شود. به اين دليل كه هر جزئي كه از ميان سل جريان عبور كند، به صورت يك نواري از جزء حل شده است، آشكارساز، پيك به شكل گوسين نرمال را ثبت مي‌كند. توانايي تركيب براي جذب تابش فرابنفش (يا مرئي) به كروموفرهاي آن در ساختار مولكولي بستگي دارد.
آشكارساز ضريب شكست (RI)
اندازه علائم آشكارساز تابعي از ضريب شكست مايع (فاز متحرك) در سل جريان مي‌يابد. وقتي اجزاء نمونه وارد سل جريان مي‌شوند ضريب شكست مايع تغيير مي‌كند و مطابق آن پاسخ آشكارساز نيز تغيير مي‌كند.
در يك آشكارساز ضريب شكست (RI) ديفرانسيلي يك سل جريان مرجع نزديك به سل جريان نمونه قرار مي‌گيرند. در اينجا نتيجه (خروجي) آشكارساز معادل است با اختلاف علائم ناشي از پرتو نمونه و پرتو مرجع. استفاده از اين نوع طراحي، توانايي اشكارسازي را بيشتر و حساسيت نسبت به تغيرات شدت منبع نور و درجه حرارت آشكارساز را كمتر مي‌كند.
بررسي باقيمانده آنتي‌بيوتيک‌ها با روش کروماتوگرافي مايع با کارايي بالا
مراحل آناليز تركيبات مورد نظر شامل 2 مرحله استخراج و سنجش بود، در مرحله اول با استفاده از روش فاز مايع – مايع تركيبات آنتي‌بيوتيک از نمونه جدا شدند و نمونه قابل تزريق به سيستم HPLC فراهم شد در مرحله دوم نمونه‌هاي استخراج شده توسط سيستم HPLC آناليز شدند. لازم به ذكر است كه قبل از انجام آناليز نمونه‌هاي واقعي، ابتدا راه‌اندازي روش سنجش HPLC و معتبرسازي آن انجام گرديد. بدين منظور غلظتهاي مختلف از تتراسايكلين وکلرامفنيکل وپنيسيلين(ng/ml 1000-0) هريك با 3 بار تكرار در روزهاي مختلف به5ccو5gr نمونه اضافه شد (Spike) و همانند مراحل شرح داده شده در روش استخراج و كروماتوگرافي، روي نمونه‌ حاوي مقادير معلوم تركيبات آنتي‌بيوتيک مراحل مذكور انجام گرديد. مشخصات آناليز شامل ميزان حساسيت، تكرارپذيري، ميزان بازيافت، خطي بودن پاسخ‌ها و عدم وجود پيك مزاحم به دست آمد.
تهيه محلول مادر
براي تهيه محلول مادر از تتراسايكلين وکلرامفنيکل وپنسيلين 10mg از اين 4دارو برداشته و هركدام جداگانه با آب مقطر ديونيزه به حجم 10cc رسانده شد. و محلول مادر با غلظت ng/ml1 براي هركدام به دست آمد و در داخل يخچال و يا در فريزر در دماي c20- نگهداشته شدند.
همچنين تتراسايكلين‌ها آنتي‌بيوتيك‌هايي ناپايداري هستند كه اغلب تغيير رنگ مي‌دهند (از زرد به قهوه‌اي) بنابراين بايد لوله‌هاي حاوي محلول مادر را در داخل فويل آلومينيومي نگهداري شود.
تهيه محلول‌هاي كاري روزانه آنتي‌بيوتيک هاي مورد نظر
محلول‌هاي استاندارد كاري با رقيق ساختن محلول مادر با آب ديونيزه ساخته مي‌شوند. محلول‌هاي كاري نيز بايد از مواجهه با نور محافظت شوند.
1cc از محلول اكسي تتراسايكلين و 1cc از محلول مادر تتراسايكلين جداگانه برداشته و با آب مقطر و با بالن ژوژه‌هاي جداگانه هر دو محلول را به حجم 10cc مي‌رسانيم تا غلظت 100 به دست بيابد و به همين ترتيب رقت‌هاي بعدي تهيه گرديد.براي آنتي بيوتيکهاي پني‌سيلين و کلرامفنيکل نيز به همين روش عمل مي کنيم.
روش استخراج
براي استخراج به ترتيب زير عمل گرديد:
10gr از نمونه را برداشته و 30ml آب به آن مي‌افزاييم با دور 2000 به مدت 10 دقيقه سانتريفيوژ کرده، سپس 20ml از مايع رويي را برداشته، 50ml اتيل‌استات به آن مي‌افزاييم. مخلوط کرده و اتيل‌استات را جدا مي‌کنيم و مي‌گذاريم خشک شود و به آن 2ml متانول مي افزاييم و 23gr نمک 6% و 20ml هگزان مي‌افزاييم سپس هگزان را خارج کرده و دور مي‌ريزيم. سپس 30ml ديگر اتيل‌استات مي‌افزاييم پس از مخلوط کردن اتيل استات را خارج کرده خشک مي‌کنيم، سپس9ml آب و 1ml متانول مي‌افزاييم و آن را تزريق دستگاه مي‌کنيم.
روش تهيه فاز متحرك
فاز متحرک: 10ml استات آمونيوم 1% اسيد استيک و 95ml متانول و 5ml آب مخلوط ميکنيم و صاف ميکنيم.

.
جداسازي باکتري‌هاي سالمونلا، اشرشياکلي و استافيلوکوک اورئوس
آماده‌سازي نمونه گوشت قرمز و سفيد
ابتدا تيغ جراحي را با فرو بردن در الکل و شعله دادن سترون شد. زماني که مقداري تيغ خنک شد يک لاي? سطحي به ضخامت 3mm از آن برداشته سپس دوباره تيغ را سوزانده و از عمق گوشت نمونه برداشته شد. بعد از توزين نمونه به اندازه 25gr آن را به Zipekipe يا کيسه استوميکر ريخته و به اندازه 9 برابر وزنش به آن محلول رقيق کننده اضافه ميگردد.
شمارش استافيلوکوک‌هاي کواگولاز مثبت در نمونه گوشت سفيد وقرمز
تلقيح: با استفاده از پيپت سترون، 0.1ml از سوسپانسيون اوليه را به پليت حاوي محيط کشت Bird Parker Agar منتقل شد. اين عمل تا ر قت 2-10 تکرار شده، در هر مورد به صورت دوتايي کار شد. با دقت و تا حد امکان به سرعت، نمونه را به کمک ميله شيشه‌اي در سطح محيط کشت پخش از تماس نمونه با جدار پليت خودداري شد. پليت‌ها به مدت زمان 15 دقيقه در دماي آزمايشگاه قرار گرفت تا مايع کشت داده شده جذب محيط کشت شود.
گرمخانه گذاري: پليت‌ها به صورت وارونه به مدت زمان 48 ساعت در دماي 37 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري شد. بعد از 48 ساعت گرمخانه گذاري کلني‌هاي مشخص به صورت کلني‌هاي سياه يا خاکستري براق و محدب به قطر 1mm تا 2.5mm که با هالهاي شفاف درآمد.
تأييد آزمون کوارگولاز: با استفاده از يک حلقه کشت سترون از هر کلني برداشته شد و به يک لوله آزمايش حاوي محيط کشت عصاره مغز و قلب منتقل گرديد، سپس در دماي 37 درجه سلسيوس به مدت زمان 24 ساعت گرمخانه گذاري شد. سپس در شرايط سترون، 0.1ml از سوسپانسيون فوق در لوله سترون به اندازه 10x75ml ريخته و 0.3ml پلاسماي خرگوش اضافه گرديد و در دماي 37 درجه سلسيوس به مدت زمان 4 تا 6 ساعت گرمخانه گذاري شد. سپس تشکيل لخته پلاسما بررسي ميشد. اگر نتيجه منفي بود تا مدت 18 تا 24 ساعت در دماي اتاق يا مدت زماني که توسط توليد کننده پلاسما سفارش شده است نگهداري ميگرديد. آزمايش کواگولاز در صورتي مثبت است که لخته تشکيل شده باشد. بعنوان شاهد براي هر بسته، 0.1ml از محيط کشت عصاره سترون مغز و قلب به مقدار توصيه شده پلاسماي خرگوش افزوده و بدون افزودن سوسپانسيون، گرمخانه گذاري ميشد و در صورتي آزمايش معتبر ميشد که نشانه‌اي از لخته در پلاسماي شاهد ديده نميشد.
بيان نتايج: تعداد کلني‌هاي مشاهده شده در آخرين رقت رشد کرده ضربدر عکس رقت در هر گرم
محيط مغز و قلب:
روش تهيه: محيط کشت آماده را که به صورت تجاري وجود داشت تهيه و طبق دستورالعمل کارخانه سازنده توسط آب مقطر ساخته شد. pH بايد طوري تنظيم ميشد که پس از سترون کردن در دماي 25 درجه سانتي‌گراد، 4/7 باشد. محيط کشت در حجم‌هاي 5ml تا 10ml به لوله مناسب منتقل شده و به مدت زمان 15 دقيقه در دماي 121 درجه سانتي‌گراد، در اتوکلاو سترون گرديد.
محيط برد پارکرآگار:
روش تهيه: محيط کامل که به صورت صنعتي آماده است توسط آب مقطر طبق دستورالعمل کارخانه ساخته شد. محيط آماده در ارلن‌هاي با گنجايش مناسب توزيع و سپس در اتوکلاو در دماي 121 درجه سيلسيوس سترون گرديد. pH آن طوري تنظيم شد که در دماي 25 درجه سانتيگراد pH آن برابر باشد. بعد از سترون کردن و خنک کردن محيط تا 45 درجه سلسيوس يک معرف به نام اگيولک به آن اضافه شد. به ازاي هر 500cc، 25cc از آن مصرف به محيط سترون شده اضافه شد. اين کار بايستي در يک محيط سترون انجام ميگرفت. سپس محيط کامل در پليت تقسيم ميشد.
پلاسماي خرگوش: به صورت تجاري وجود دارد.
آماده کردن پليت‌ها: مقدار مناسبي از محيط کشت کامل به درون پليت‌هاي سترون ريخته به گونه‌اي که ضخامت محيط کشت حدود 4ml باشد و به حال گذاشته شد تا محيط ببندد. پليت‌ها را مي‌توان به مدت زمان 24 ساعت در دماي 3 درجه سلسيوس نگهداري نمود.

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید