ه نقش بسيار مهمي را ايفا مي‌کند که حدوداً بايد بين 2-1 دقيقه باشد.
4- نمونه را با استفاده از يک وسيله کوبنده آن را کاملاً مي‌کوبيم تا يک شيره مناسب از آن استخراج شود.
5- µl 100 از شيره استخراج شده را براي انجام آزمون استفاده مي‌کنيم.
1-زرده وسفيده تخم مرغ را در يک تويوپ تميز مي ريزيم به هم مي زنيم تا يک ماده يکنواخت به دست ايد
2-1ميليتر از نمونه را با 3 ميليتر آب مقطر مخلوط کرده و در يک تيوپ پلاستيکي مقاوم به حرارت به قطر 1/5 cm ميريزيم و حرارت مي دهيم
3-نمونه ها را به مدت 12 دقيقه در دماي 100 در حمام اب گرم قرار مي دهيم
4-به مدت 30-20 ثانيه آن را مخلوط مي کنيم تا از لخته شدن آن جلوگيري کنيم و سپس آن را در دماي اتاق مي گذاريم تا سرد شود
5-100ميکروليتر از مخلوط را براي آزمون استفاده مي کنيم.
براي آماده سازي نمونه هاي شير به روش تخم مرغ عمل مي کنيم.
نحوه انجام آزمون:
1- با يک قيچي تعداد تويوپي که براي آزمون نياز هست را بريده و استفاده مي‌کنيم. مواظب باشيد که فويل يا سرپوش تويوپ‌هاي باقي مانده برداشته نشود تا از خشک شدن آن‌ها جلوگيري شود و به سرعت آن را به دماي 16-4 درجه سانتيگراد برگردانيد.
2- تويوپ‌ها را براي حفاظت بيشتر در يک جعبه به صورت ايستاده نگهداري کنيد سرپوش‌هاي تويوپ را برداشته و ml 100 از نمونه آماده شده را توسط پيتي که در کيت وجود دارد به تويوپ‌ها اضافه کنيد. مي توان يک نمونه کنترل منفي يا يک نمونه کنترل مثبت که با اسقفاده از استانداردهاي آنتي‌بيوتيک مورد نظر آلوده شده در يک تويوپ ديگر در کنار تويوپ حاوي نمونه داشته باشيم.
3- تويوپ‌ها را براي 20 دقيقه در دماي اتاق انکوبه کنيد.
4- تويوپ‌ها را برگردانده و محتويات آن را خارج کنيد. تويوپ‌ها را با آب مقطر چند بار پر و خالي کنيد تا شسته شوند. تمام آب مورد شستشو را با برگرداندن تويوپ بر روي يک دستمال يا حوله کاملاً خارج کنيد تا قطره‌اي آب در تويوپ باقي نماند. براي 4 بار عمل شستشو را انجام دهيد.
5- تويوپ‌ها را با يک سرپوش چسبنده پوشانده و آن را در دماي 65 درجه سانتيگراد انکوبه کنيد.
6- هنگامي که نمونه کنترل منفي به رنگ زرد درآمد بايد انکوباسيون متوقف شود. که حدوداً مدت زمان براي ديدن اين نشانه 3-2 ساعت است.
7- تويوپ‌ها را از کنار نگاه کنيد و نتيجه را بخوانيد و هر نمونه را با نمونه کنترل منفي مقايسه کنيد.
رنگ بنفش مايل به قهوه‌اي نشانه مثبت بودن و رنگ زرد نشانه منفي بودن آزمون است. هر رنگي به غير از رنگ نمونه کنترل منفي نشانه اين است که نمونه‌ها حاوي آنتي‌بيوتيک هستند. اگر جواب‌هاي بدست آمده مشکوک باشد بايد آزمون دوباره انجام شود.
روش کوروماتوگرافي مايع
کروماتوگرافي مايع در اواخر دهه 1960 و اوايل دهه 1970 کشف شد. امروزه به طور گسترده از آن براي خالص سازي و استخراج مواد استفاده مي‌کنند. در صنايعي همچون داروسازي، بيوتکنولوژي، پليمر و صنايع مواد غذايي از آن استفاده مي‌شود. بيشتر از يک دهه است که کوروماتوگرافي مايع به عنوان يک روش مؤثر براي انواع مواد به کار گرفته شده است.
در روش کوروماتوگرافي مايع نياز به مواد فرار نيست. در نتيجه اين يک مزيت نسبت به روش GC به حساب مي‌آيد. کوروماتوگرافي مايع براساس تزريقي کوچک از نمونه مايع در يک بخار مايع به نام فاز متحرک استوار است. که در يک ستون با ذره‌هايي ثابت محصور شده است.
جداسازي مخلوط مورد نظر و اجزاي تشکيل دهنده آن به درجه تحمل و نگهداري هر جزء در ستون بستگي دارد. اندازه هر جزء در ستون به وسيله جزء‌بندي بين فاز مايع متحرک و فاز ساکن تعيين مي‌گردد. در کوروماتوگرافي مايع اين جزء‌بندي بر اثر تقابل مواد حل نشده موجود در فاز ساکن و مواد حل نشده در فاز مايع است. بنابراين برعکس روش GC هر تغيير در فاز مايع باعث يک تغيير بزرگ بر روي جداسازي مواد مي‌شود. وقتي مواد تحرک مختلف داشته باشند در زمان‌هاي مختلفي در ستون ديده مي‌شوند.
جدا کننده‌هاي مختلفي وجود دارند که مي‌توان در فاز مايع از آن استفاده کرد. اين دستگاه مواد موجود در فاز مايع را شناسايي مي‌کند و آن را به سيگنال‌هاي الکتريکي برمي‌گرداند. قابل ذکر است هرگونه تغيير در شرايط اپراتور باعث مي‌شود که بر روي زمان نگهداري و ابقا تاثير گذار باشد و باعث مخدوش شدن جواب نهايي گردد. زمان ابقا زماني است که بين تزريق و جداسازي تعريف شده است. در ادامه اجزاء دستگاه HPLC را توضيح مي‌دهيم.
فاز متحرك
انتخاب صحيح تركيب درصد و نوع فاز متحرك در انجام مؤثر آزمايش‌ها بسيار مهم مي‌باشد، زيرا فاز متحرك متغيري است كه براي جداسازي موفق نقش مهمي برعهده دارد. اما دامنه انتخاب ما به دليل ستون و فاز ساكني كه انتخاب مي‌كنيم محدود است و تمايز (مشخصه) اصلي بين كروماتوگرافي فاز معكوس و فاز نرمال مي‌باشد. در سيستم فاز نرمال، حلال‌هاي غيرقطبي مانند هگزان يا ايزواكتان به كار مي‌رود. در حاليكه در فاز معكوس از حلال‌هاي قطبي مانند انتخاب فاز متحرك مناسب با توجه به خواص فيزيكي حلال انجام مي‌گيرد. فاكتورهايي كه در اين گزينش مي‌تواند به ما كمك كند عبارتند از: قطبيت، قابليت حل شدگي با حلال‌هاي ديگر، بي اثر بودن از لحاظ شيميايي، طول موج نقطه قطع فرابنفش و سميت. ضريب قطبيت معياري از قابليت يك حلال براي شستن يك جزء از درون ستون است.
در جدول 3-1 خلاصه‌اي از حلال‌هاي رايج كه به عنوان فاز متحرك مورد استفاده قرار مي‌گيرند ارائه شده و همچنين به بعضي از پارامترها كه نقش مهمي در انتخاب فاز متحرك مناسب دارند اشاره شده است.
جدول ‏3-1: حلال‌هاي متداول براي فاز متحرك در HPLC
حلال
ضريب قطبيت
طول موج قطع (nm)UV
سميت
فاز نرمال
هگزان
1/0
210
سمت عصبي مزمن
ايزواكتان
1/0
205
كم
دي اتيل اتر
8/2
218
كم
دي كلرومتان
1/3
245
سرطان زا
ايزوپروپيل الكل
9/3
205
كم
فازبرگشتي
آب
2/10
200
غيرسمي
متانول
1/5
210
سميت متوسط
استونيتريل
8/5
210
سمي توسط استنشاق (تنفس)
تتراهيدروفوران
0/4
280
سمي توسط استنشاق (تنفس)

سيستم HPLC را مي‌توان براي دو نوع شستشو تنظيم كرد: تك شويي و گرادياني.
* شستشوي تك شويشي در جايي استفاده مي‌شود كه تركيب فاز متحرك در خلال آزمايش ثابت مي‌ماند.
* شستشوي گرادياني در جايي استفاده مي‌شود كه تركيب فاز متحرك در خلال آزمايش براي كسب تفكيك بهتر، همراه با كاهش زمان آزمايش، مكرراً تغيير مي‌يابد.
پمپ
مهم‌ترين وظيفه پمپ در سيستم HPLC عبور دادن مداوم فاز متحرك در درون ستون كروماتوگرافي است. دو نوع اصلي پمپ براي سيستم HPLC وجود دارد. سرنگي و پيستوني.
پمپ سرنگي
پمپ‌هاي نوع سرنگي به دليل اينكه بدون ضربان (پالس) عمل مي‌كنند، براي انجام آزمايش جذابيت بيشتري دارند. ولي حجم كل فاز متحركي كه مي‌توان با اين نوع پمپ‌ها به ستون تحول داد محدود است، زيرا پمپ سرنگي ظرفيت كمي دارد. اين پمپ‌ها در مقايسه با پمپ‌هاي پيستوني گران‌ترند.
پمپ پيستوني
چرخش يك چرخ دنده مركزي موجب حركت دو پيستون به شيوه متقابل (جايگزيني) مي‌شود. اين امر به نوبه خود فاز متحرك را از مخزن كشيده و با فشار آن را به سوي ستون مي‌فرستد.
سوپاپ اطمينان وقتي مايع از آن عبور مي‌كند باز، و وقتي كه عبور نمي‌كند خود به خود بسته مي‌شود با هر حركت بالا و پايين رفتن، سوپاپ‌ها باز و بسته مي‌شوند. به اين ترتيب اطمينان حاصل مي‌شود كه جريان حركت فاز متحرك از مخزن به ستون هميشه يك طرفه باقي بماند. حجم فاز متحركي كه با هر چرخش كامل چرخ دنده از مخزن به ستون منتقل مي‌شود برابر است. اين سيستم طرح نسبتاً ساده‌اي دارد كه به دليل داشتن يك مخزن بزرگ توان بالايي در استمرار ورود فاز متحرك به ستون را دارد. سرعت جريان عبور فاز متحرك را مي‌توان به سادگي از طريق تغيير در سرعت موتور (چرخ دنده) بالا يا پايين بود. يكي از معايب اين نوع پمپ ايجاد ضربان در فاز متحرك است.
انژكتور (محل تزريق)
انژكتور در HPLC برخلاف كروماتوگرافي گازي عموماً داراي طرحي ساده است. نمونه از طريق يك سرنگ وارد حلقه مي‌شود و مقدار كافي از نمونه حلقه را پر مي‌كند. مايع اضافي از طريق دريچه‌ها خارج شده، سپس انژكتور به وضعيت تزريق تغيير وضعيت مي‌دهد. در اين حالت ابتداي اين حلقه به پمپ و انتهاي آن به ستون وصل است. نمونه موجود در درون حلقه توسط جريان فاز متحرك به بالاي ستون منتقل مي‌شود. چنين طرحي به حلقه انژكتور اين توانايي را مي‌دهد كه محيط با فشار ثابتي پر گردد. اين امر موجب مي‌شود كه فشار برگشتي حاصله از ستون كاهش يابد. همچنين از نشت انژكتور و سپتوم هم جلوگيري مي‌كند. به اين دليل كه حجم حلقه مشخص است، پروسه تزريق از قابليت تكرارپذيري بالايي برخوردار است و به سيستم HPLC اين توانايي را مي‌دهد كه براي سنجش‌هاي كمي مورد استفاده قرار گيرد. حلقه‌ها قابل تعويض هستند، پس اين امكان را فراهم مي‌كند كه بتوان حجم تزريق را بر اساس ميزان مورد نياز انتخاب نمود.
ستون
ستون مهم‌ترين قسمت يك دستگاه كروماتوگرافي است و در تعيين كارآيي و قدرت تفكيك كل سيستم HPLC نقش حياتي دارد. تصميم‌گيري براي انتخاب ستون در درجه اول به نوع كروماتوگرافي مورد استفاده بستگي دارد. براي مثال كروماتوگرافي فاز نرمال يا فاز برگشتي.
براي جزئيات بيشتر تجزيه گر بايد به راهنماي سازندگان ستون مراجعه كند. امروزه بسياري از سازندگان ستون‌ها، وب سايت مخصوص خود را دارند، كه با مراجعه به آن مي‌توان اطلاعات مفيدي درباره انواع ستون‌ها و كاربردي‌هاي مناسب آن كسب نمود.

جدول ‏3-2: فازهاي ساكن HPLC و كاربردهاي رايج آنها
فاز ساكن
نوع
كاربرد
فاز متحرك
آناليت‌هاي رايج
سيليكا

فاز نرمال
هگزان، الكل‌ها
حشره‌كش‌ها و محصولات طبيعي
اكتادسيل سيليل (ODS)
زنجير هيدروكربني C18
فازبرگشتي
آب، متانول، استونيتريل، بافرها (pH:8-2)
پپتيدها و آمينواسيدها
‍C8
زنجير هيدروكربني C8
فاز برگشتي
ODS را ببينيد
داروها و تركيبات دارويي
سيانوپروپيل (CN)
گروه سيانوپروپيل پيوند يافته با نگهدارنده سيليكا
فاز نرمال و فاز برگشتني
فاز برگشتي: آب، الكل
فاز نرمال: هگزان، اتر
غذا و اسيدهاي چرب
آمينوپروپيل (CH2)
گروه آمينوپروپيل پيوند يافته با نگهدارنده سيليكا
فاز نرمال و فاز برگشتني
فاز برگشتي: آب، الكل
فاز نرمال: هگزان، اتر
سورفاكتانت‌ها
پيركل (Pirkle)
انانتيومر فنيل گلايسين پيوند يافته با نگهدارنده سيليكا
جداسازي‌هاي يوني كايرالي كارآيي بيشتري دارند اما خيلي محكم نيست
هگزان، اصلاح كننده‌ها
حشره‌كش‌ها و علف‌كش‌ها

ستون‌هاي فاز برگشتي
اين ستون‌ها تنوع‌پذيرند و خصوصيات فاز ساكن اين ستون‌ها با نيازهاي بسياري از نمونه‌هايي كه مورد آزمايش قرار مي‌گيرند مطابقت دارد.
مواد فاز ساكن را مي‌توان با كيفيت بالا توليد كرد، به طوري كه در شرايط نرمال آزمايش، پايداري قابل قبولي را داشته باشد.
ترتيب شستشوي موادي كه در حال جداسازي هستند را به راحتي مي‌توان بر اساس ميزان اب گريزي آنها پيش‌بيني كرد.
فازهاي متحرك مخلوط ساده‌اي از حلال‌هاي آبي هستند، آب كه عموماً جزء اصلي آن را تشكيل مي‌دهد ارزان، بي‌خطر و فراوان است.
انواع ستون
انواع مختلفي از ستون‌هاي فاز برگشتي وجود دارند كه بر اساس گروه‌هاي عاملي متصل به “نگهدارنده سيليكا” دسته‌بندي و مشخص مي‌شوند. جدول 3-3 برخي از انواع رايج ستون‌هاي فاز برگشتي را نشان مي‌دهد. براي درك كاملتر دلايل پيشرفت، پركننده‌هاي فاز برگشتي مي‌توان به مرجع شماره 7 مراجعه كرد.

جدول ‏3-3: ستون‌هاي فاز برگشتي رايج و ميزان قطبيت نسبي

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید