five quinolones) در شير گاو در قا نون اروپا از روش LC/MS/MS استفاده مي‌شود. براي ساده‌تر شدن روش براي آمادگي نمونه‌ها مرحله حذف پروتئين به حلال آلي حذف شد. پاک سازي SPE و غلضت سازي به وسيله OASIS HLB CARTRIDGE انجام شد. پاک سازي و استخراج آنتي‌بيوتيک بدست آمده با استفاده از ستون C8 با يک شيب شستشو در 11 دقيقه انجام شد. 89% از داروهاي جدا شده 65% بالاتر از انتظار بود.AMOX %57 DAN %38 . LOD اعداد بدست آمده از 03/0 تا 5/0 g/kgµ است وLOQ از 1/0 تا 25/1g/kg µ است. اين روش براي 49 نمونه انجام شد.37% از نمونه‌ها به اين روش جواب نداده و يا امکان وجود اشتباه در انها زياد بود. از بررسي آناليز تمام نمونه‌ها 14% از نمونه‌ها حاويAMOX و 16% حاوي PENG بود. AMOX وPENG معمولاً به عنوان باقي مانده آنتي‌بيوتيکي در نمونه‌هاي شير جدا شده.
[16]1000 نمونه شير خام گاو از تبريز و سراب به صورت تصادفي انتخاب و نمومنه برداري شد از مارچ 2010 تا نوامبر 2010 تمام شيرها به وسيله تستCOPAN (CHR.HANSEN.DENMARK) آزمايش شدند. حدود 5% از نمونه‌هاي شمال غرب ايران مثبت بودند و داراي باقي مانده آنتي‌بيوتيک بودند. اين بررسي نشان داد که کنترل مانيتورينگ شير در منطقه شمال غرب ايران براي کنترل و شناسايي با قيمانده آنتي‌بيوتيکي ضرورت دارد.
[7] نمونه‌هاي گوشت از بزهاي عمان و سومالي و گوسفندهاي استراليا و سومالي به صورت اتفاقي تهيه شد. اين نمونه برداري در طول آپريل 2004 انجام شد. از کيت‌هاي مخصوص الايزا براي جدا سازي باقيمانده آنتي‌بيوتيک و عوامل آنابوليک استفاده شد. به طور معمول نمونه‌هاي گوشت حاوي باقي آنتي‌بيوتيکي بودند. تتراسيکلين بين 53ppkg-44 (mean49.8) و استرپتومايسين 20-0 (mean 11) کلرامفنيکل بين /0-0/08 (mean 0/02) است. عوامل آنابوليک با قيمانده در گوشت بين 0-0/05 و0-35 و براي کلسترول17، 0-0/16 و بتاتستسترون و تربنولون هم امکان وجود داشت. به هر حال مقدار اين با قيمانده‌ها کمتر از استانداردي بود که توسط GRCP وEU تعيين شده است. گوشت بز سومالي که مقدار کمي آنتي‌بيوتيک و عوامل آنتي‌بيوتيک داشت با گوشت ديگر حيوانات مقايسه شد که به عنوان گوشت سالم و مطمئن براي مصرف کننده ارائه شده بود. گوسفندهاي استراليا مقدار باقيمانده کم ولي بزهاي سومالي داراي باقيمانده زيادي بودند. معمولاً گوشت بزها آنتي‌بيوتيک و عوامل آنابوليک بيشتري نسبت به گوشت گوسفندان داشتند با يک تفاوت معني دار در تتراسايکلين. اين تفاوت در گوشت‌هاي بز سومالي بيشتر ديده شد. اين تحقيقات نشان داد که گوشت گوسفند و بز فروخته شده در عمان معمولاً حاوي مقداري از باقيمانده‌هاي ‌آنتي‌بيوتيکي و عوامل آنابوليکي است.

مواد و روش‌هاي استفاده شده
مواد
مواد و محلول‌ها مصرفي
Sample dilution buffer (20 ml, 4? concentrated)
Rinising buffer (30 ml, 20? concentrated)
Substrate solution (12 ml, ready to use)
Stop solution (15 ml, ready to use)
Conjugate (lyophilized, blue cap)
Antibody (lyophilized, yellow cap)
Standard solution 100 ng/ml (1 ml, ready to use)
Recontitution/zero Standard buffer (10 ml, ready to use)
Standard solution 1
Standard solution 2
Standard solution 3
Standard solution 4
Standard solution 5
Standard solution 6
اتيل استات(merk )
ايزواکتان/ تريکلرومتان(Merk)
ان‌هگزان) Merk )
استات امونيوم(Merk )
اسيد استيک اسيد(Merk )
متانول(merk )
Lauryl Sulfate Broth، Lot Number: 1.10266.0500، Expire Date: 2017/6/6، (Merk)
Selenit enrich ment، Lot Number: 1.07717.0500، Expire Date: 2015/02/21، (Merk)
Salmonella shigella Agar، Lot Number: 1.07667.0500، Expire Date: 2015/03/24، (Merk)
Triple Suger Iron Agar، Lot Number: 1.03915.0500، Expire Date: 2015/09/27، (Merk)
SIM Medium، Lot Number: M181-500G، Expire Date: 2013/11، (Himedia)
Urea Agar، Lot Number: 1.08487.0500، (Merk)
Lysine Decarboxylase Broth، Lot Number: M376-500G، Expire Date: 2014/12، (Merk)
Anti Serum، Lot Number: 9202، (BaharAfshan)
Salmonella Anti Serum Poly Serogroups A
Salmonella Anti Serum Poly Serogroups B
Salmonella Anti Serum Poly Serogroups C
Salmonella Anti Serum Poly Serogroups D
Lactose Broth، Lot Number: 1.07661.0500، Expire Date: 2016/08/03، (Merk)
EC Broth، Lot Number: 1.0765.0500، Expire Date: 2016/05/04، (Merk)
Tryptone Water، Lot Number: 1.10859.0500، Expire Date: 2016/05/19، (Merk)
Bird Parker Agar، Lot Number: 1.05406.0500، Expire Date: 2016/08/29، (Merk)
کيت‌هاي مصرفي
تتراسايکلين
اين کيت داراي يک پليت است که داراي 12رديف و 8خانه است که با يک انتي بادي تتراسايکلين کد شده است.horseradish peroxidase lable tetracycline به عنوان کونژوگه و استاندارد تتراسايکلين نيز به خانه هاي نيز کد شده است. تتراسايکلين وکونژوگه باهم بر سر اتصال به گيرنده هاي تتراساکلين رقا بت دارند.بعد از 1ساعت انکوباسيون تمام عواملي که اتصال پيدا کردند توسط بافر شستشو مي شوند.
اتصال کونژوگه با افزودن سوبسترا افزايش مي يابد و باعث رنگي شدن کونژوگه مي‌شود.واکنش سوبسترا و کونژوگه با اضافه کردن محلول سوبسترا که محلولي از سولفوريک اسيد است متوقف ميشود. شدت رنگ توليد شده د رطول موج 450 نانومتر خوانده مي‌شود .مقدار عدد مورد نظر بدست امده با مقدار رنگ توليد شده نسبت عکس دارد.دقت اندازه گيري اين کيت براي شير 0.4ng/ml وبراي گوشت 2.9ng/ml وبراي تخم مرغ 4.0ng/ml است.
نحوه نگهداري :
1-کيت بايد در يک محل تاريک در دماي c°8 تا c°2 تا نگهداري شود.
2-بعد از گذشتن تاريخ انقضاء ديگر نمي‌توان از آن استفاده کرد چون کيفيت آن پايين مي‌آيد و باعث مخدوش شدن آزمون مي‌گردد.
3-رقيق سازي محلول‌ها بايد قبل از مصرف ا نجام شود. البته ابتدا بايد تمامي مواد به دماي محيط برسد.
4-بعد از رقيق کردن کونژوگه ميتوان آن را تا زمان ا نقضا در دماي 20- درجه سانتيگراد نگهداري کرد. سوبسترا را تا زمان انقضاي کيت در دماي c°8 تا c°2 مي‌توان نگهداري کرد.بعد از ساختن رقت هاي مختلف از استاندارد 2ng/ml مي توان ان را تا پايان انقضا در 20-درجه سانتيگراد نگهداري کرد.
5-از هر تماس نوري با محول سوبسترا بايد جلوگيري کرد. اگر رنگ محلول سوبسترا قبل از اضافه کردن آن به خانه‌ها آبي باشد ويا واکنش رنگي Zero stardard (Bmax) در طول موج 450mm کمتر از 0.8 باشد نشان دهنده بي کيفيت بودن محلول‌ها مي‌باشد.

Tetracycline Fast ELISA، Code: 5091TC، Expire Date:2013/05، (EuroProxima)
Microtiter Plate، Lot Number: NN6063، ٍExpire Date: 2013/06
Conjugate، Lot Number: NN5725، Expire Date: 2013/06
Standards 2 ng/ml، Lot Number: NN572 Expire date:2013/05
MTC buffer، Lot Number: NN6138، Expire Date: 2013/05
Dilution buffer، Lot Number: NN5793، Expire Date: 2014/06
Rinsing buffer، Lot Number: NN5903، Expire Date: 2014/07
TMB substrate، Lot Number: NN6515، Expire Date: 2014/07
Stop Solution، Lot Number: NN5969، Expire Date: 2014/07
کلرامفنيکل
کيت الايزاي اندازه‌گيري کلرامفنيکل داراي يک پليت با 12 رديف که هر کدام 8 خانه است که کف هر خانه بايک انتي بادي LgG کد شده است همراه با آنتي بادي اختصاص براي کلرامفنيکل است. کونژوگه و استانداردها و نمونه مورد آزمايش به خانه هايي که آنتي بادي کف آنها کد شده اضافه مي‌گردد و بين هر مرحله انکوبه مي‌شوند. آنتي بادي اختصاصي به صورت بي‌حرکت کف خانه‌ها ثابت شده‌اند. آنزيم کونژوگه و کلرامفنيکل آزاد که در استانداردها و نمونه ها وجود دارد بر سر جايگاههاي اتصال آنتي بادي رقابت مي‌کنند. بعد از 30 دقيقه انکوباسيون تمام موادي که اتصال پيدا نکرده‌اند. توسط بافر شوينده شسته مي‌شوند. کونژوگه توسط محلول سوبسترا نشان داده مي‌شود. کونژوگه به سوبسترا متصل شده و باعث مي‌شود که کونژوگه رنگ بگيرد.
واکنش سوبسترا توسط محلول stop که شامل سولفوريک اسيد متوقف مي‌شود. اين رنگ در طول موج 450mm خوانده مي‌شود. دقت اندازه‌گيري اين کيت در نمونه شيرد 0.2 ng/ml، در نمونه تخم مرغ 0.02 ng/ml و در نمونه گوشت 0.02 ng/ml مي‌باشد.مقدار رنگ توليد با عدد به دست امده نسبت عکس دارند.
نحوه نگهداري :
1-کيت بايد در يک محل تاريک در دماي c°8 تا c°2 تا نگهداري شود.
2-بعد از گذشتن تاريخ انقضاء ديگر نمي‌توان از آن استفاده کرد چون کيفيت آن پايين مي‌آيد و باعث مخدوش شدن آزمون مي‌گردد.
3-رقيق سازي محلول‌ها بايد قبل از مصرف انجام شود. البته ابتدا بايد تمامي مواد به دما برسد.
4-بعد از رقيق سازي آنتي بادي ليوفيليزه مي‌توان به مدت 6 ماه آن را دماي c°8 تا c°2 نگهداري کرد. کونژگه نيز بعد از رقيق سازي به مدت 2 ماه در دماي c°8 تا c°2 قابل نگهداري است. همچنين مي‌توان از اين محلول رقت‌هايي تهيه کرد که اين رقت‌ها را به مدت 1 سال در c°20 – مي‌توان نگهداري کرد. سوبسترا و محلول هاي استاندارد را تا زمان انقضاي کيت در دماي c°8 تا c°2 مي‌توان نگهداري کرد.
5-از هر تماس فري با محول سوبسترا بايد جلوگيري کرد. اگر رنگ محلول سوبسترا قبل از اضافه کردن آن به خانه‌ها آبي باشد و يا واکنش رنگي Zero stardard (Bmax) در طول موج 450mm کمتر از 0.8 باشد نشان دهنده بي کيفيت بودن محلول‌ها مي‌باشد.

Chloramphenicol Fast ELISA، Code: 5091CAPF، Expire Date: 2013/05، (EuroProxima)
MicroTiter Plate، NN5817 Lot Number:، Expire Date: 2013/12
Conjugate، Lot Number: NN6574، Expire Date: 2013/12
Standards 0.04,0.1,0.2,0.4,1,4 ng/ml،Expire Date:2014/06
Standard 100 ng/ml، 12/2013 Expire Date:
Antibody، Lot Number: NN6577، Expire Date: 2014/06
Dilution buffer، Lot Number: NN5864، Expire Date: 2014/06
Reconstitution buffer، Lot Number: NN5865، Expire Date: 2014/06
Rinsing buffer، Lot Number: NN5903، Expire Date: 2013/07
TMB substrate، Lot Number: NN5991، Expire Date: 2014/11
Stop solution، Lot Number: NN5998، Expire Date: 2014/07
پني‌سيلين
اين کيت (Explorer 2.0) بر پايه بازداري رشد ميکروارگانيسم‌ها پايه‌گذاري شده است. کيت از لوله‌هاي منفرد تشکيل شده است که هر لوله شامل محيط کشت همراه با اسپور باکتري ترموفيليک ژئوباسيلوس و يک انديکاتور PH است.
در مرحله انکوباسيون در 65 درجه سانتيگراد اسپور شروع به رشد کرده و سلول‌ها اسيد توليد مي‌کنند و PH محيط را تغيير مي‌دهند. تغيرات PH باعث تغيير رنگ محيط از آبي / بفنش به زرد مي‌شود. وقتي داراي غلظت بالايي از باز دارنده بنابراين حد تشخيص کيت پايين آمده و هيچ‌گونه رنگي تغيير نمي‌کند. اجزاي کيت بايد در دماي 16 تا 14 درجه سانتي‌گراد نگهداري شوند و از برخورد مستقيم نور به آنها ممانعت شود. نيمه عمر کيت توليد شده حدود 9 ماه مي‌باشد.کمترين مقداري که اين کيت مي‌تواند تشخيص دهد20ppb است.
تجهيزات مورد استفاده
Shaker
سانتريفيوژ (2000?g)
Sampler 1000, 100 µl
تويوپ 50 ml و 5 ml
پمپ خلا
Elisa reader
دستگاه HPLC
فاز متحرک: 10ml استات آمونيوم 1% اسيد استيک و 95ml متانول و 5ml آب مخلوط مي کنيم و صاف مي کنيم.
ستون C18
طول موج (نانومتر): 220 پني‌سيلين، 280 کلرامفنيکل،

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید