320 تتراسايکلين
سرعت جريان: 1 ml/min
حجم تزريق: 25 ميکروليتر
نوع آشکارساز: UV
برنامه نرم‌افزاري براي کنترل سيستم و جمع‌آوري اطلاعات:milinium
کاتر
Zipe Kipe
Bag Mixer
Sigma 500cc
Plate
Pipet 10cc
ارلن ماير 500cc
ارلن ماير 250cc
لوله آزمايش
حلقه کشت
گرم خانه 37 درجه سانتي‌گراد
گرم خانه 42 درجه سانتي‌گراد
لام و لامل
کواکس
لوله دورهام
ترازو
سوزن کشت
روش اريمونواسي
ايمونواسي يک راه ساده و کوتاه از تقابل آنتي‌ژن و آنتي‌بادي است. اين روش خيلي قوي و مؤثر براي اندازه‌گيري واحد‌هاي خيلي کوچک مانند ng/ml و pg/ml در محلول‌هايي همچون پلاسما، ادرار و محيط‌کشت‌هاي سوپرناتانت استفاده مي‌شوند. به طور اساسي در روش ايمونواسي از يک آنزيم براي اتصال آنتي‌ژن به آنتي‌بادي استفاده مي‌شود. اين آنزيم باعث مي‌شود که سوبستراي بي‌رنگ داراي يک رنگ خالص شوند که اين امر نشان دهنده آنتي‌ژن به آنتي‌بادي است. اين روش مي‌تواند به صورت‌هاي مختلف آنتي‌ژن و آنتي‌بادي را شناسايي کند. اين موضوع بستگي به طراحي آزمايش مورد نظر دارد.
بررسي باقيمانده تتراسايکلين‌ها با روش ايمونواسي
روش آماده‌سازي نمونه‌هاي
شير:
ابتدا بايد چربي شير گرفته شود چون چربي شير مي‌تواند يکي از عوامل باشد که باعث مخدوش شدن جواب هاي آزمايش شود. PH شير نيز بايد در نظر گرفته شود چون شير ترش شده مي‌تواند کيفيت آزمايش را تحت تأثير قرار دهد.
1-شير سرد را در دما °c4 به مدت 15 دقيقه در دور 2000 سانتريفوژ کرده
2-به وسيله يک کاردک چربي جمع شده بر سطح نمونه را جمع آوري کرده
3-0/75ml از نمونه اي که چربي آن گرفته شده را به يک لوله تميز منتقل مي کنيم و 0/25ml MTC بافر به آن اضافه نمود و به وسيله vortex آن را محفوظ مي کنيم.
4-100µl از شير بدون چربي را در 200µl Sample dilution buffer اضافه کرده و سپس با vertex آن را مخلوط مي کنيم.
5-?l 50اين محلول را براي آزمايش الايزا استفاده مي کنيم.
گوشت (قرمز، سفيد):
1-1گرم از بافت گوشت را بريده و آن را چرخ مي کنيم و در يک لوله تميز مي ريزيم.
2-./5mL آب مقطر به آن اضافه مي کنيم و 1/5 mL متانول 100% سپس به وسيله vortex آن را به خوبي مخلوط مي کنيم.ذ
3-در دماي °25-°20 در دور 2000 آن را سانتريفيوژ مي کنيم.
4- 60 ?l از محلول را بهdilution buffer350 ?l اضافه کرده و آن را به وسيله vortex به خوبي مخلوط مي کنيم.
5-50µl از محلول را براي آزمايش الايزا استفاده مي کنيم.
تخم مرغ:
1-1گرم از يک تخم مرغ يک دست مخلوط شده را به يک لوله 15mL پلاستيکي اضافه مي کنيم.
2-McIIvain buffer l mL با 1 PH به آن اضافه مي گردد (1 : 1 با متانول رقيق مي‌شود).
4- 50 ?l از محلول سوپر ناتانت را به يک لوله تميز جديد منتقل مي کنيم و 200ml dilution buffer به آن اضافه مي کنيم.
5-50?l از محلول را بر آزمايش الايزار استفاده مي کنيم.
روش‌هاي آماده‌سازي محلول‌هاي مورد استفاده در آزمون :
Microtiter plate : نوارهايي که براي آزمايش قابل استفاده نيستند به سرعت بايد به داخل يخچال برگردانده شود اما نوارهايي که بايد براي آزمايش استفاده مي‌شود بايد به دماي محيط برسند.
در اين کيت دو بافر وجود دارد TC buffer, dilution buffer M
Dilution buffer : بافر براي آماده سازي کونژوگه و Sample dilation buffer استفاده مي‌شود و قبل از مصرف بايد به نسبت 4 : 1 به وسيله آب مقطر رقيق شود. بافر ديگر به نام buffer MTC است که براي رقيق کردن نمونه شير از آن استفاده مي‌شود.
Sample dilution buffer : اين بافر به صورت آماده در کيت وجود نداشته و بايد آماده شود. Dilution buffer 18mL را به همراه 2mL متانول 100% مخلوط کرده آن را تا زمان استفاده در °c8 – °c2 نگهداري مي‌کنيم.
McIIvain buffer : 0/2 از محلول سديم ديباکسيد را به همراه ? 0/2 از محلول تري سديم سيترات دهيرات را آماده مي کنيم و هر دو را با آب مقطر به حجم 1 ليتر مي رسانيم دو محلول را مخلوط کرده و آن را با HCLبه PH 7مي رسانيم قبل از مصرف با متانول به نسبت 1 : 1 بايد رقيق شود.

Standarl 2ng/ml :
بايد چند رقت از استاندارد تتراسايکلين تهيه شود. ابتدا 2ml sampel dilution buffer به استاندارد تتراسايکلين اضافه مي کنيم اين محلول حاوي 2ng تتراسايکلين در ml است. 0.25ml از اين محلول را به يک لوله تميز منتقل کرده و Sample dilution buffer 0.25ml به آن اضافه کرده اين عمل را تکرار مي‌کنيم تا رقت هاي 1/0 ، 0/5 ، 0/25 ، 0/025 ، 0/0625 را بسازيم.
Conjugate: ويال ليوفيليزه کونژگه را با 6ml از dilution buffer مخلوط کرده و آن را در يک جاي تاريک نگهداري مي کنيم.
Rinsing buffer : محلول شستشو بايد قبل از مصر به صورت تازه ساخته شود براي هر نوار 40mL محلول شستشو استفاده مي‌شود.
Substrate/chrowogen sdution :
محلول سوبسترا به صورت آماده در کيت وجود دارد.
روش اجرايي آزمون الايزا
1-نمونه‌ها محلول‌هاي مورد استفاده در آزمون طبق دستور العمل‌ها ساخته مي‌شود.
2- 100MLاز sam ple dliution buffer: در خانه‌هاي دوتايي H1 ، H2 مي‌ريزيم که اين خانه‌ها حاوي نمونه کنترل منفي مي‌باشد.
Sample ditution buffer 50?l در خانه هاي دوتايي A2 و A1 مي‌ريزيم که اين خانه‌ها حاوي نمونه‌هايي کنترل مثبت مي‌باشد.
50?l از هر محلول استاندارد در باقي خانه به صورت دوتايي مي ريزيم B1 تا I1 که به ترتيب شامل 0.0625 ، 0.125 ، 0.25 ، 0.5 ، 1.5 و 2.0 ng?mL مي‌باشد.
4- 50?l از محلول کونژوگه به تمام خانه ها اضافه مي‌شود به غير از خانه هاي H2 و H1
5-پليت حاوي محلول ها را به روي يک شيکر گذاشته و براي دقايقي آن را به خوبي مخلوط مي‌کنيم.
6-پليت را براي 1 ساعت در ماي 25°c تا 20°c در يک محل تاريک انکوبه مي کنيم.
7- محتويات داخل پليت را خالي کرده و 3 بار آن را با محلول شستشو مي شويم.
8- 100?l از محلول سوبسترا به تمام خانه ها اضافه مي کنيم.
9-پليت را براي 30 دقيقه در دماي 25°c تا 20°c در يک محل تاريک انکوبه مي کنيم.
10- 100?l از محلول stop را به تمام خانه ها اضافه مي کنيم.
11-به سرعت پليت را به وسيله دستگاه Elisa Reader در محلول موج 450nm مي‌خوانيم.
12-توسط نرم افزار OD هاي بدست آمدره را محاسبه کرده.
روش شستشو
در اين آزمون بين هر مرحله بايد محتويات داخل پليت بايد شسته شود.
1-محتويات داخل پليت را با برگرداندن آن خالي کرده و با کوبيدن پليت بر روي يک دستمال تميز آن را کاملاً تخليه مي کنيم.
2-تمام خانه هاي استفاده شده را با 300?l از محلول شستشو پر مي کنيم.
3-اين عمل 3 بار بايد انجام شود.
4-پليت را با کوبيدن بر روي يک دستمال تميز کاملاً خشک مي کنيم.
5- بايد توجه داشت که تمام خانه ها به طور کامل خشک شده و قطره ايي از محلول شستشو باقي نمانده باشد.
بررسي باقيمانده کلرامفنيکل با روش ايمونواسي
روش آماده‌سازي نمونه‌ها
شير:
نمونه‌هاي براي آزمايش به صورت مستقيم بايد به نسبت 1 به 4 با sample dilution buffer رقيق شود.
روش مستقيم: براي انجام اين آزمون به صورت مستقيم بايد چربي شير به صورت دائمي گرفته شود و گرنه باعث مخدوش شدن جواب آزمون مي‌شود.
ديگر فاکتور تأثيرگذاري برروي آزمون PH نمونه‌ها شير است. شيري که PH اسيدي دارد باعث به وجود آمدن خطا در آزمون مي‌شود.
شير سرد را براي 15 دقيقه در دور2000 در دماي 4 درجه سانتگيراد.سانتريفيوژ مي کنيم. فاز بالايي محلول را که چربي شير مي‌باشد را با کاردک جمع مي‌کنيم. شير بدون چربي را با نسبت 1 به 4 با sample dilution buffer رقيق مي‌کنيم.
sample dilution buffer 300?l را به 100 ميکروليتر شير اضافه مي‌کنيم 50 ميکروليتر آن را براي آزمون استفاده مي‌کنيم.
تخم مرغ:
1 گرم از يک تخم مرغ کاملاً يک دست و يکنواخت را به يک لوله تميز انتقال مي‌دهيم 6 mlاتيل استات به آن اضافه کرده و آن را به مدت 1 دقيقه کاملاً مخلوط مي‌کنيم. هنگامي که آن را به شدت مخلوط کنيم محلول مورد نظر تبديل به يک ژله مي‌شود. بعد آن را به مدت 10 دقيقه دردور 2000 سانتريفيوژ مي کنيم.3 ml از لاي? رويي را به يک لوله تميز منتقل مي‌کنيم.
محتويات لوله را در 50 درجه سانتيگراد زير بخار نيتروژن تبخير مي‌کنيم به چربي باقيمانده 1mlاِن هگزان و 0/5 ml با sample dilution buffer اضافه مي‌کنيم و آن را به مدت 1 دقيقه مخلوط مي‌کنيم و بعد آن را به مدت 10 دقيقه در دور2000 سانتريفيوژ مي‌کنيم. سپس لوله را به مدت 5 دقيقه در حمام آب گرم در دماي °80 مي‌گذاريم و سپس دوباره سانتريفيوژ مي‌کنيم. 50 ميکروليتر از لاي? زيرين از محلول را براي آزمون اصلي بر مي‌داريم.
گوشت:
استخراج به وسيله اتيل استات صورت مي‌گيرد. ابتدا بايد به صورت کامل گوشت چرخ شود و به يک مخلوط همگن تبديل شود3gr از مخلوط را برداشته و به يک لوله تميز منتقل مي‌کنيم و 6ml اتيل استات به آن اضافه مي‌کنيم و به مدت 10 دقيقه آن را مخلوط مي‌کنيم. سپس آن را به مدت 10 دقيقه در دور 2000 سانتريفيوژ مي‌کنيم 4ml از محلول رويي را برداشته، و به يک لوله تميز ديگر منتقل مي‌کنيم و سپس در دماي 50 درجه سانتيگراد زير بخار نيتروژن آن را تبخير مي‌کنيم.
به چربي باقي مانده 1ml اِن هگزان و1ml sample dilution buffer اضافه کرده و بعد آن را به مدت 1 دقيقه به شدت مخلوط مي‌کنيم و سپس به مدت 10 دقيقه آن را سانتريفيوژ کرده سپس لوله را به مدت 5 دقيقه در يک حمام آب گرم در دماي 80 درجه سانتيگراد گذاشته. لوله مورد نظر با محتويات داخل آن سانتريفيوژ کرد، و 50 ?l از مايع زيرين را برداشته و براي آزمون اصلي از آن استفاده مي‌شود.
ر وش آماده سازي محلول هاي مورد استفاده در آزمون
از تمام مواد و محلول‌هاي داخل کيت مي‌توان براي يک پليت 96 خانه‌اي استفاده کرد از هر استاندارد و نمونه بايد به صورت دوتايي براي آزمون استفاده کرد.
Micro titre plate : نوارهايي که براي آزمايش قابل استفاده نيستند به سرعت بايد داخل يخچال برگردانده شود اما نوارهايي که بايد براي آزمايش استفاده شود بايد به دماي محيط برسند.
Rinsing buffer : محلول شستشو بايد قبل از مصرف به صورت تازه ساخته شود براي هر نوار 40mL محلول شستشو استفاده مي‌شود.
substrate: محلول سوبسترا به صورت آماده در کيت وجود دارد.
Conjugate : ويال ليوفيليزه را با 4ml از با reconstitution/zerostandard buffer مخلوط کرده و آن را در يک محل تاريک نگه مي‌داريم.
antibody : ويال ليوفيليزه را با 4ml از reconst itution /zero standard buffer مخلوط کرده و در يک محل تاريک نگه مي‌داريم.
sample dilution buffer : اين بافريي که در کيت وجود دارد 4 بار غليظ شده است بنابراين قبل از مصرف بايد با آب مقطر رقيق شود. 20ml از بافر بايد با 40ml از آب مقطر رقيق شود. بايد قبل از مصرف به دماي اتاق رسيده کاملاً به هم زده شود.
Standard (100ng/ml) : براي ساخت رقت‌هاي استاندارد بايد از محلول استانداري که حاوي 100ng/ml کلرامفنيکل است استفاده شود بايد رقت هاي 4 ، 1 ، 0.4، 0.2 0.04ng/ml ساخته شود. اين رقت‌ها به صورت آماده درکيت وجود دارد.
بررسي باقيمانده پني‌سيلين
نحوه آماده‌سازي نمونه‌ها:
1- 3 گرم از نمونه گوشت را برداشته و به قطعات کوچک تبديل مي‌کنيم.
2- نمونه قطعه قطعه شده را در يک تويوپ شيشه‌اي يا پلاستيکي که قطر آن حدوداً cm 1/5 باشد بريزيد که به گرما مقاوم باشد. درب آن را ببنديد اما درب تويوپ را خيلي محکم نکنيد.
3- تويوپ را در ميکروويو گذاشته زمان در اين مرحل

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید