1-5-بيماريها و عوارض 11
1-6- روش‏هاي تشخيص کلاسيک: 13
1-7-اپيدميولوژي 14
1-7-1-جلوگيري از پنوموني 14
فصل دوم: پيشينه پژوهش 16
2-1- مقدمه 17
2-2- تاريخچه 18
فصل سوم: روش شناسي 21
3-1- مواد و وسايل: 22
3-2- دستگاه ها: 24
3-3- محلول سازي: 25
3-3-1- آماده سازي محيط کشت: 25
3-3-2- محيط شکلات اگار: 26
3-3-3- آماده سازي ژل اگارز 1 درصد: 27
3-4- طراحي و روش اجرا: 27
3-4-1- جمع‏آوري نمونه: 27
3-5- کشت نمونه ها: 27
3-6- تست ‌هاي بيوشيميايي: 28
3-7- رنگ آميزي: 29
3-8- نگهداري ايزوله‌هاي باليني هموفيلوس آنفلوانزا در شرايط کرايو در دماي -80ْ: 29
3-9- استخراج DNA 30
3-9-1-استخراج DNA به روش جوشاندن: 30
3-10- بررسي کيفيت و کميت DNAاستخراج شده: 30
3-11- راه اندازي و انجام PCR: 31
3-12- واکنشPCR 32
3-13- الکتروفورز محصول PCR: 35
3-13-1- مواد و وسايل مورد نياز: 35
3-13-2- نحوه تهيه ژل اگارز و انجام الکتروفورز: 35
3-14- تفسير ژل الکتروفورز 36
3-15- RFLP 36
3-15-1- استخراج باند اصلي از روي ژل اگارز 37
3-15-2- بررسي غلظت محصولات تخليص شده توسط دستگاه نانودراپ: 37
3-16- مواد و وسايل لازم براي RFLP: 37
3-16-1- روش انجام RFLP باآنزيمAlu1: 38
3-16-2- انجامRFLP باآنزيم محدودالاثر EcoR1: 38
3-17- تعيين توالي و پردازش داده ها: 38
3-17-1- ارسال نمونه‏ها جهت توالي يابي قطعه تکثير شده: 39
فصل چهارم: تجزيه و تحليل داده ها 40
4-1- تعداد نمونه‏ها و ايزولاسيون: 41
4-2-تستهاي بيوشيميايي: 42
4-3-نتايج بررسي کميت و کيفيت DNA استخراج شده: 42
4-4- PCRژن ompP2 ايزوله‌هاي باليني هموفيلوس آنفلوانزا: 43
4-5- RFLP: 44
4-6: نتايج تعيين توالي (Sequencing) و ثبت توالي‌ها درديتابيسGeneBank/EMBL: 45
4-7- آناليز بازهاي حاصل از تعيين توالي نمونه ها: 46
4-7-1- آناليز بازهاي حاصل از تعيين توالي ايزوله باليني شماره 3: 46
4-7-2. آناليز بازهاي حاصل از تعيين توالي ايزوله باليني شماره 5: 47
4-7-3- آناليز بازهاي حاصل از تعيين توالي ايزوله باليني شماره 8: 48
4-7-4- آناليز بازهاي حاصل از تعيين توالي ايزوله باليني شماره 35: 49
4-7-5- آناليز بازهاي حاصل از تعيين توالي ايزوله باليني شماره 47: 50
4-7-5- آناليز بازهاي حاصل از تعيين توالي ايزوله باليني شماره14: 51
4-8- بررسي ميزان شباهت و تفاوت ايزوله‌هاي باليني تهران: 52
فصل پنجم: بحث و نتيجه گيري 56
5-1- آناليز RFLP از ايزوله‌هاي باليني: 57
5-2. آناليز و بررسي جهش‌هاي ايجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ايزوله شماره 3: 57
5-2-1آناليز و بررسي جهش‌هاي ايجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ايزوله شماره 5: 58
5-2-2- آناليز و بررسي جهش‌هاي ايجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ايزوله شماره 8: 58
5-2-3- آناليز و بررسي جهش‌هاي ايجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ايزوله شماره 35: 59
5-2-4- آناليز و بررسي جهش‌هاي ايجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ايزوله شماره 14: 60
5-2-5- آناليز و بررسي جهش‌هاي ايجاد شده در ساختمان ژن ompP2 ايزوله شماره 47: 60
5-3- بحث: 61
پيشنهادات: 66
منابع 67
فهرست منابع 68
Abstract 75
پيوست ها 76

فهرست جداول
عنوان صفحه

جدول3-1- مواد تشکيل دهنده و مقدار حجم آنها براي PCRاز ompP2 34
جدول 3-2- برنامه PCR براي تکثير ژن ompP2 34
جدول3-3- توالي پرايمرهاي مورد استفاده براي ompP2 35
جدول 4-1- اطلاعات نمونه‌هاي دريافتي از بيماران مورد مطالعه 41
جدول 4-2 نتايج بررسي کميت و کيفيت DNA استخراج شده 42
جدول 4-3- نتيجه Blast سکانس نوکلئوتيدي شماره 3 در NCBI 47
جدول 4-4- نتيجه Blast سکانس نوکلئوتيدي شماره 5 در NCBI 48
جدول 4-5- نتيجه Blast سکانس نوکلئوتيدي شماره 8 در NCBI 49
جدول 4-6- نتيجه Blast سکانس نوکلئوتيدي شماره 35 در NCBI 50
جدول 4-7- نتيجه Blast سکانس نوکلئوتيدي شماره 47 در NCBI 51
جدول 4-8-. نتيجهBlast سکانس اسيد نوکئيک شماره 14 در NCBI 52

فهرست اشکال
عنوان صفحه

شکل1-1- ساختارشيميايي پلي ريبوزيل ريبيتول فسفا ت 3
شکل1-3- کلو ني‌هاي هموفيلو س آنفولانزا روي محيط شکلات اگار 5
شکل3-1-تست کاتالاز 29
شکل 3-2- شکل باسيل گرم منفي هموفيلوس آنفلوانزا 30
شکل 3-3- دستگاه ترموسايکلر 34
شکل 3-4- دستگاه الکتروفورز 36
شکل4-1- ژن ompP2 ايزوله‌هاي با ليني 43
شکل 4-2و4-3- جايگاه برش آنزيم محدودالاثر Alu1براي ژنompP2 ايزوله‌هاي باليني 44
شکل 4-4- جايگاه برش آنزيم محدودالاثر ECOR1براي ژن ompP2ايزوله‌هاي باليني 44
شکل 4-5- کروماتوگرام به دست آمده از تعيين توالي ژن ompP2 نمونه شماره 14با پرايمر Forward 45
شکل 4-6- کروماتوگرام به دست آمده از تعيين توالي ژن ompP2نمونه شماره 14با پرايمر Revers 45
شکل 4-7- آناليز و مقايسه نمونه شماره 3 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسي توالي اسيدآمينه آنها 46
شکل 4-8- مناطق حفاظت شده پروتئين شماره 3 46
شکل 4-9- آناليز و مقايسه نمونه شماره 5 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسي توالي اسيدآمينه آنها 47
شکل 4-10- مناطق حفاظت شده پروتئين شماره 5 47
شکل 4-11- آناليز و مقايسه نمونه شماره 8 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسي توالي اسيدآمينه آنها 48
شکل 4-12- مناطق حفاظت شده پروتئين شماره 8 48
شکل 4-13- آناليز و مقايسه نمونه شماره 35 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bankو بررسي توالي اسيدآمينه آنها 49
شکل 4-14- مناطق حفاظت شده پروتئين شماره 35 49
شکل 4-15- آناليزو مقايسه نمونه شماره 47با اطلاعات ثبت شده در Gene Bankو بررسي توالي اسيدآمينه آنها 50
شکل 4-16- مناطق حفاظت شده پروتئين شماره 47 50
شکل 4-17- آناليزو مقايسه نمونه شماره 14 با اطلاعات ثبت شده در Gene Bank و بررسي توالي اسيدآمينه آنها 51
شکل 4-18- نواحي حفاظت شده پروتئين شماره 14 51
شکل 4-19- مقايسه ساختماني اسيدآمينه پروتئينP2 ايزوله‌هاي باليني با همديگر 54

فهرست نمودارها
عنوان صفحه

نمودار 4-1- نتايجRFLP 52
نمودار 4-2- ميزان درصد هر يک از الگو ها 53
نمودار 4-3- درصد جهش ها 53

فصل اول:
کليات

1-1-تاريخچه وطبقه بندي:
هموفيلوس آنفولانزا اولين بار در پاندمي ‌ويروس آنفولانزا توسط فايفر1 در سال 1892 معرفي شد ( (Murley et al, 1988 (Reddy et al, 1996. فايفر گزارش کرد در نمونه خلط بيماران مبتلا به آنفولانزا يک باکتري ناشناخته مشاهده شده، که نام آن را باسيل فايفر گذاشت و تا چندين سال تصور بر اين بود که اين باکتري عامل بيماري آنفولانزا است به همين خاطر به آن آنفولانزا نيز مي‏گفتند. بعدها مشخص شد که اين باکتري به عنوان يک عفونت ثانويه در دستگاه تنفسي مبتلايان به ويروس آنفولانزا مطرح است (Peltola H, 2000). چهل سال بعد از فايفر، پيتمن2 نشان داد که هموفيلوس آنفولانزا مي‏تواند به دو دسته کپسول‏دار و بدون کپسول تقسيم شود. وي شش تايپ پلي ساکاريد کپسولي از اين باکتري را بر مبناي خاصيت آنتي ژنيک آنها معرفي کرد که کپسول آنها مسئول ويرولانس ارگانيسم است. ساختار اين کپسول‏ها بعدها شناسايي شد. اين شش تايپ راa تاf ناميدند (;Cotter D et al, 2002 ;Murley et al, 1998 (Murphy et al, 1993; Reddy et al, 1996 . (از بين اين شش سروتايپ کپسول‏دار، سروتايپ b هموفيلوس آنفولانزا (Hib) تقريبا در 90 درصد موارد ابتلا، اصلي‏ترين عامل مننژيت باکتريايي در کودکان زير 5 سال، عامل 95 درصد بيماري‏هاي مهاجم ديگري همچون باکتريمي، پنوموني و سپتي سمي‌ در کودکان و مسئول نيمي ‌از بيماري‏هاي مهاجم بزرگسالان همچون سلوليت، اپي‏گلوتيت، لارنژيت و ارتريت چرکي مي‏باشد (;Haase et al, 1994 (Murphy et al, 1993.
پيتمن همچنين مشاهده کرد که تمام سويه‏هاي جدا شده از مايع نخاعي و خون بيماران از تايپ b کپسول‏دار است (Reddy et al, 1996). عفونت سيستمي‌در کودکان توسط گونه‏هاي اين باکتري در سراسر دنيا اتفاق مي‏افتد و ميزان شيوع آسيبهاي نورولوژيک، اين باکتري را به يک نگراني عمومي ‌براي سلامت افراد تبديل کرده‏است (; Haase et al, 1994 ( Murley et al, 1998.اين باکتري توسط کپسول پلي‏ساکاريدي از جنس قند پنج کربنه (پنتوز) که پلي‏مري از واحدهاي تکراري پلي ريبوزيل ريبيتول فسفات 3 (PRP)مي‌باشد، از فاگوسيتوز توسط ماکروفاژها محافظت مي‏گردد (Reddy et al, 1996) ; Kubiet&Ramphal, 1995) .).
جنس پلي‏ساکاريد در ساير سروتايپ‏هاي کپسول‏دار از قندهاي شش کربنه (هگزوز) مي‏باشد. به عنوان مثال کپسول تايپ a پلي‏مري از گلوکز ريبيتول فسفات است(Musser et al, 1986).

شکل1-1- ساختار شيميايي پلي ريبوزيل ريبيتول فسفات

کانون اوليه عفونت در سويه‏هاي کپسول‏دار معمولاً نازوفارنکس است و کپسول در استقرار باکتري در سطوح مخاطي و مقاومت باکتري در مقابل پاسخ‏هاي ايمني در مکان استقرار نقش دارد. سويه‏هاي تايپ e و f بعد از تايپ b، رايج‏ترين سويه‏هاي طبقه‏بندي شده هستند که مي‏توانند بيماري ايجاد کنند. همچنين بيماري ناشي از تايپ a هم گزارش شده است. موارد مننژيت ايجاد شده توسط سروتايپ‏هاي a و e و f نيز گزارش شده، اگرچه دقيقا مشخص نيست مننژيت معمول‏ترين بيماري کلينيکي اين سروتايپ‏ها باشد (Cotter et al, 2002).
75 درصد سويه‏هاي هموفيلوس آنفولانزا فاقد کپسول هستند که به انواع “غير قابل طبقه‏بندي”4 (NTHi) معروفند. اين سويه‏ها در قسمت فوقاني دستگاه تنفس کلونيزه شده و کانون اوليه عفونت حلق و بيني است، اگرچه امکان گسترش دامن? عفونت از اين نواحي به ساير نقاط مثل سينوس‏ها و گوش مياني وجود دارد، که مي‏تواند باعث عفونت گوش‏مياني(اوتيتيس مديا)5 در بچه‏هاي خردسال شود(Murphy et al, 1993) .(Kubiet&Ramphal, 1995;Reddy et al, 1996;Moreno , 1999)همچنين از سويه‏هاي فاقد کپسول بيماري‏هايي همچون سينوزيت، کانژاکتيويت6، پريکارديت و اندومتريت گزارش شده است (Sukupolvi-Petty et al, 2006).
1-2-مشخصات ميکروسکوپي و ماکروسکوپي:
هموفيلوس آنفولانزا کوکوباسيل‏ گرم منفي، کوچک (3/0 × 1 ميکرومتر)، غيرمتحرک، بدون اسپور، بي‏هوازي اختياري و سخت رشد از خانواده پاستورلاسه است. پلي‏مورفيسم به خصوص در باکتري‏هاي جدا شده از کشت کهنه مشهود بوده و مي‏توان آن را به اشکال کوکوئيد، کوکوباسيل، باسيل و يا اشکال رشته‏اي مشاهده کرد ((Sukupolvi-Petty et al, 2006;Reddy et al, 1996.
بر روي محيط کشت جامد شکلات ‏اگار کلوني‏هاي باکتري صاف، بي‏رنگ تا مايل به خاکستري، بسيار کوچک به ‏قطر 2-1 ميلي ‏متر بعد از 24 ساعت انکوباسيون ظاهر مي‏شوند. مورفولوژي باکتري به محيط و سن کشت بستگي دارد. در کشت‏هاي 8-6 ساعته در محيط کشت غني، کوکوباسيل‏هاي کوچک برتري دارند و در کشت‏هاي کهنه اشکال ميله‏اي بلند Sukupolvi-Petty et al, 2006)).
1-3- کشت:
کشت باکتري در محيط شکلات اگار انجام مي‏گيرد. اين باکتري بسيار حساس است و براي رشد خود به هر دو فاکتور X و V موجود در خون نياز دارد که به اين ترتيب با ديسک‏گذاري در محيط شکلات اگار از ساير گونه‏هاي هموفيلوس متمايز مي‏شود
(Cotter et al, 2002، (Reddy et al, 1996;Pickering et al, 2002;. دماي 37-35 درجه سانتي‏گراد، وجود ايزو ويتال X در محيط و 5 درصد دي ‏اکسيدکربن باعث رشد بهينه باکتري مي‏گردد. هموفيلوس آنفولانزا بر روي محيط بلاداگار با خون گوسفند رشد نکرده و هموليز ايجاد نمي‏کند، تنها اطراف کلوني‏هاي استافيلوکوک به دليل ليز گلبول‏هاي قرمز و ترشح فاکتور XوV (پديد? اقماري) مي‏تواند رشد کند

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید